Kolonie PCR
Was ist Kolonie PCR?
Die Definition der Kolonie PCR ist:
Kolonie PCR die Siebung von bakteriellem (E.Coli) oder von Hefe klont für korrekte Verbindung- oder Plasmidprodukte. Vorgewählte Kolonien des Bakteriums oder der Hefe werden mit einer sterilen toothpick oder Pipettespitze von einer Platte des Wachstums (Agarose) ausgewählt. Dieses wird dann in die PCR Hauptmischung eingesetzt oder vor-eingesetzt in sterilisiertes Wasser. PCR wird dann geleitet, um festzustellen, wenn die Kolonie das DNA Fragment oder das Plasmid des Interesses enthält.
Bakterielles Protokoll Der E.Coli Kolonie-PCR
Schnelle Vorbereitung Methode Der Kolonie-PCR
Schritt 1:
Wählen Sie eine bakterielle Kolonie mit einer sterilisierten toothpick oder Pipettespitze aus und wirbeln Sie es in 25 μL TE sterilisiertes dH2O in einem sterilisierten microfuge Schlauch. Entfernen Sie nicht die gesamte Kolonie, und kennzeichnen Sie den Bereich, den Sie preferrably Zahl die Unterseite der Platte auswählten (und des microfuge Schlauches).
Schritt 2:
Heizen Sie die Mischung in einem Siedewasserbad oder
heißen Heizung (90-100C) Block für 2 Minuten
Schritt 3:
Spinnen Sie Probe für 2 Minuten Schnell in Zentrifuge.
Schritt 4:
Bringen Sie 20 μL des Supernatant in einen neuen microfuge Schlauch.
Schritt 5:
Nehmen Sie 1-2 μL des Supernatant als Schablone in einem 25 μL PCR Standard-PCR Reaktion.
Protokoll Der Hefe-Kolonie-PCR
Nehmen Sie Hefezellen, die auf einer Platte gewachsen wurden, die vom Brutkasten 37C frisch ist (frisch gewachsene Hefe sind besser)
Nehmen Sie eine sterilisierte toothpick oder Pipettespitze und berühren Sie ein wenig Hefekolonie. Reiben Sie nicht weg eine vollständige Kolonie. Verschieben Sie sie in ein Standard-PCR mastermix.
PCR Einen.Kreislauf.durchmachenzustände:
Erster Denaturierender Schritt: 95 °C, 5 Minuten
Denaturieren Des Schrittes: 95 °C, 30 sek
Ausglühen-Schritt: 50-55 °C, 30 sek
Verlängerung Schritt: 72 °C, 1min/kb
Wiederholen Sie Schritts 2-4: 34mal
Abschließende Verlängerung: 72 °C, 3 Minuten
Laden Sie die gesamte PCR Reaktion auf 1% Agarosegel.
Kolonie PCR - Pubmed Erschienene Forschung
Direktes PCR des intakten Bakteriums (Kolonie PCR). In Verbindung stehende Artikel
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Curr Protoc Microbiol. May;Appendix 2008 3:Appendix 3D
Autoren: Woodman ICH
Dieses Protokoll beschreibt eine leistungsfähige Methode für das Aussortieren des intakten Bakteriums für das Vorhandensein der gewünschten DNA Reihenfolgen mit Polymerasekettenreaktion (PCR). Diese Methode gekennzeichnet allgemein als Kolonie PCR.
PMID: 18770531 [ PubMed - im Prozeß ]