In-situ-PCR
Definition von in-situ-PCR
In-situ- PCR (ISH) ist eine Polymerasekettenreaktion, die wirklich innerhalb der Zelle auf einem Dia stattfindet. In-situ- PCR Verstärkung kann an örtlich festgelegtem Gewebe oder an Zellen durchgeführt werden.
In-situ-PCR Einleitung
Während der Einführung und der Weiterentwicklung der Krankheit, können minuziöse Quantitäten eines Produktes in den kleinen Bevölkerungen der Zellen oder Gewebe für die Pathogenese der Krankheit lebenswichtig sein.
In vielen langsam-entwickelnden Krankheiten, die Monate oder sogar Jahre erfordern, um sich klinisch zu verkünden, ist es, daß die Majorität der betroffenen Zelle Bevölkerung in einem transcriptionally unaktivierten Zustand ist, und auf einem Niveau von einem Gen pro Wirtszelle gezeigt worden.
Nukleinsäurehybridationmethoden und die Polymerasekettenreaktion (PCR) sind beide eingesetzt worden, um den Ausdruck und die Abfragung solcher betroffener Gene während der Pathogenese zu überprüfen. Während beide diese Techniken ziemlich nützlich sind, ist der Nachteil dieser Techniken, daß sie im Wesentlichen Zelle Ausdruck und Bevölkerung Studien leiten. Nukleinsäuren werden von einer Bevölkerung der Zellen, die entweder eine genügende Anzahl von Molekülen enthält, um direkt durch Standardhybridationtechniken zu ermitteln, oder lokalisiert, wenn eine Unterbevölkerung so wenig wie eine einzelne Kopie der Nukleinsäure, von diesem Molekül, das durch das PCR verstärkt wird und nach Verstärkung ermittelt ist enthält.
In-situ hybridation (ISH) wendet die Methodenlehre der Nukleinsäurehybridationtechnik am zellularen Niveau an. Kombinieren cytochemistry und immunocytochemistry, in-situ-PCR erlaubt, daß die Kennzeichnung der zellularen Markierungen gekennzeichnet wird und ermöglicht weiter die Lokalisation Zelle zu der spezifischen Reihenfolgen innerhalb der Zelle Bevölkerungen, wie Gewebe und Blutproben.
In-situ-PCR wird auf die Abfragung des non-genomic Materials wie RNS, Gene oder Genome begrenzt, da die Nachweisgrenze in den meisten Bedingungen einige Kopien der Nukleinsäure des Ziels pro Zelle ist. Folglich wegen der Kopie Zahlbeschränkungen, Hybridation von RNS ist empfindlicher als DNA Abfragung.
Die Faktoren, die in-situ-PCR Empfindlichkeit beeinflussen, schließen ein:
1) das strandedness des Zielmoleküls
2) das Fehlen von einer ergänzenden Reihenfolge proximal zu den Zielreihenfolgen
Heben Sie transcriptase-katalysierte in-situ übertragung ist sogar verwendet worden, RNAs zu ermitteln auf, die an der verhältnismäßig hohen Kopie Zahl auftreten.
In-situ-PCR (ISH) Protcol
Zuerst bildet die Stöchiometrie der Nukleinsäurebestandteile die Zündkapsel-gefahrene Reaktion. Während die Reaktion jedoch fortfährt, fängt das PCR Produkt selbst an, als Ziel für weitere Verstärkung, sowie eine Zündkapsel für weitere Verlängerung zu arbeiten. Es ist die Ansammlung der Reihenfolgen, die in den mehrfachen Reaktionen verlängert werden, die durch die örtlich festgelegte Zelle behalten wird und als das Ziel für die radioaktive Prüfspitze in der Abfragung Phase dient.
Die komplizierte körperliche Natur innerhalb einer örtlich festgelegten Zelle behindert die Leistungsfähigkeit der Polymerase sowie Diffusion (Zerstäubung) und Ausglühen, und folglich sind Verlängerungzeiten viel länger als die, die unter wäßrige geleitet werden, Zustände (Standard-PCR). Optimales Signal ist producted normalerweise mit einer minuziösen Verlängerung 15.