In-situ-PCR
Definition von in-situ-PCR
In-situ-PCR (ISH) ist eine Polymerasekettenreaktion, die wirklich innerhalb der Zelle auf einem Plättchen stattfindet. In-situ-PCR-Verstärkung kann an örtlich festgelegtem Gewebe oder an Zellen durchgeführt werden.
In-situ-PCR-Einleitung
Während der Inbetriebnahme und der Weiterentwicklung der Krankheit, können minuziöse Quantitäten eines Produktes in den kleinen Bevölkerungen der Zellen oder Gewebe für die Pathogenese der Krankheit lebenswichtig sein.
In vielen langsam-entwickelnden Krankheiten, die Monate oder sogar Jahre benötigen, um sich klinisch zu verkünden, ist es, dass die Majorität der betroffenen Zellenbevölkerung in einem transcriptionally unaktivierten Zustand ist, und auf einem Niveau von einem Gen pro Wirtszelle gezeigt worden.
Nukleinsäurehybridationmethoden und die Polymerasekettenreaktion (PCR) sind beide eingesetzt worden, um den Ausdruck und die Abfragung solcher betroffenen Gene während der Pathogenese zu überprüfen. Während beide diese Techniken ziemlich nützlich sind, ist der Nachteil dieser Techniken, dass sie im Wesentlichen Zellenausdruck- und -bevölkerungsstudien leiten. Nukleinsäuren werden von einer Bevölkerung der Zellen, die entweder eine genügende Anzahl von Molekülen enthält, um direkt durch Standardhybridationtechniken zu entdecken, oder lokalisiert, wenn eine Unterbevölkerung so wenig wie ein einzelnes Exemplar der Nukleinsäure, von diesem Molekül, das durch den PCR verstärkt wird und nach Verstärkung entdeckt ist enthält.
In-situhybridation (ISH) wendet die Methodenlehre der Nukleinsäurehybridationtechnik an der zellularen Stufe an. Die Kombination von Cytochemistry und von immunocytochemistry, in-situ-PCR erlaubt, dass das Kennzeichen der zellularen Markierungen identifizierent wird und ermöglicht weiter die Lokalisation zu der spezifischen Reihenfolgen der Zelle innerhalb der Zellenbevölkerungen, wie Gewebe und Blutproben.
In-situ-PCR wird auf die Abfragung des non-genomic Materials wie RNS, Gene oder Genome begrenzt, da die Nachweisgrenze in den meisten Bedingungen einige Exemplare der Nukleinsäure des Ziels pro Zelle ist. Folglich wegen der Exemplarzahlbeschränkungen, Hybridation von RNS ist empfindlicher als DNA-Abfragung.
Die Faktoren, die in-situ-PCR-Empfindlichkeit beeinflussen, umfassen:
1) das strandedness des Zielmoleküls
2) das Fehlen von einer ergänzenden Reihenfolge proximal zu den Zielreihenfolgen
Heben Sie transcriptase-katalysierte in-situübertragung ist sogar verwendet worden, um RNAs zu entdecken auf, die an der verhältnismäßig hohen Exemplarzahl auftreten.
In-situ-PCR (ISH) Protcol
Zuerst bildet die Stöchiometrie der Nukleinsäurebestandteile die Zündkapsel-angetriebene Reaktion. Während die Reaktion jedoch fortfährt, fängt das PCR-Produkt selbst an, als Ziel für weitere Verstärkung, sowie eine Zündkapsel für weitere Verlängerung zu arbeiten. Es ist die Aufspeicherung der Reihenfolgen, die in den mehrfachen Reaktionen verlängert werden, die durch die örtlich festgelegte Zelle beibehalten wird und als das Ziel für die radioaktive Prüfspitze in der Abfragungsphase auftritt.
Die komplizierte körperliche Natur innerhalb einer örtlich festgelegten Zelle behindert die Leistungsfähigkeit der Polymerase sowie Diffusion und Ausglühen, und folglich sind Verlängerungzeiten viel länger als die, die unter wässrige geleitet werden, Zustände (Standard-PCR). Optimales Signal producted normalerweise unter Verwendung einer minuziösen Verlängerung 15.