Umgekehrtes PCR
Umgekehrter PCR Hintergrund
Umgekehrtes PCR auch angerufener IPCR und wurde zuerst von Ochman et al. 1988 (1) beschrieben.
Eine Beschränkung von Standard-PCR ist, daß angrenzende
Regionen 5' und 3' Ihres DNA Fragments des Interesses bekannt müssen.
Umgekehrtes PCR erlaubt Ihnen, PCR zu leiten, wenn Sie nur die
Informationen von einer internen Reihenfolge haben.
Kettenreaktion der umgekehrten Polymerase ist eine Variante von PCR und wird verwendet, wenn nur eine interne Reihenfolge der Ziel DNA bekannt. Es ist folglich sehr nützlich, wenn man angrenzende DNA Reihenfolgen der genomic Einsätze kennzeichnet. Ähnlich anderen PCR Methoden, verstärkt umgekehrtes PCR Ziel DNA mit DNA Polymerase.
Umgekehrtes PCR verwendet Standard-PCR
(Polymerasekettenreaktion), gleichwohl es die Zündkapseln sich
orientieren läßt in der Rückwärtsrichtung der üblichen
Lagebestimmung. Die Schablone für die Rückzündkapseln ist ein
Beschränkung Fragment, das nach sich verbunden worden ist, um einen
Kreis zu bilden.
Die Umgekehrte PCR Methode
Die umgekehrte PCR Methode schließt eine Reihe Verdauung und Selbst-Verbindungen mit der DNA ein, die durch einen Beschränkung Endonuclease geschnitten wird. Dieser Schnitt ergibt eine bekannte Reihenfolge an jedem Ende der unbekannten Reihenfolgen.
Umgekehrte PCR Schritte
1) wird Ziel DNA leicht in kleinere Fragmente
einiger kilobases durch Beschränkung Endonucleaseverdauung
geschnitten.
2) wird Selbst-Verbindung unter den niedrigen Konzentrationen
verursacht, die das Phosphatrückgrat veranlassen zu verbessern.
Dieses gibt ein kreisförmiges DNA Verbindungprodukt.
3) ist Ziel DNA dann die Beschränkung, die mit einem bekannten
Endonuclease verdaut wird. Dieses erzeugt einen Schnitt
innerhalb der bekannten internen Reihenfolge, die ein lineares Produkt
mit bekannten Terminalreihenfolgen erzeugt. Dieses kann für PCR
(Polymerasekettenreaktion) jetzt verwendet werden.
4) wird Standard-PCR mit den Zündkapseln geleitet, die zu den
jetzt bekannten internen Reihenfolgen ergänzend sind.
In der Zusammenfassung:
Umgekehrtes PCR arbeitet, um die Reihenfolgen zu klonen, die eine bekannte Reihenfolge angrenzen. Angrenzende DNA Reihenfolgen werden und verbunden dann verdaut, um kreisförmige DNA zu erzeugen.
Die PCR Zündkapseln, die weg von den bekannten
Reihenfolgen zeigen, werden dann eingesetzt, um die angrenzenden
Reihenfolgen zu verstärken.
Anwendungen umgekehrten PCR
Umgekehrtes PCR hat zahlreiche Anwendungen in der molekularen Biologie einschließlich die Verstärkung und die Kennzeichnung der Reihenfolgen, die transposable Elemente angrenzen, und die Kennzeichnung der genomic Einsätze.
Umgekehrtes PCR Protokoll
Umgekehrte PCR Hinweise
1. Ochman H, Gerber WIE, Hartl DL. Genetik. 1988 Nov;120(3):621-3.