Umgekehrter PCR
Umgekehrter PCR-Hintergrund
Umgekehrter PCR auch benanntes IPCR und wurde zuerst von Ochman et al. 1988 (1) beschrieben.
Eine Beschränkung von Standard-PCR ist, dass 5 ' und 3 ' angrenzende Regionen Ihres DNA-Fragments des Interesses bekannt müssen. Umgekehrter PCR erlaubt Ihnen, PCR zu leiten, wenn Sie nur die Informationen von einer internen Reihenfolge haben.
Umgekehrte Polymerasekettenreaktion ist eine Variante von PCR und wird verwendet, wenn nur eine interne Reihenfolge der Ziel DNA bekannt. Es ist folglich sehr nützlich, wenn man angrenzende DNA-Reihenfolgen der genomic Einsätze identifizierent. Ähnlich anderen PCR-Methoden, verstärkt umgekehrter PCR Ziel DNA unter Verwendung der DNA-Polymerase.
Umgekehrter PCR verwendet Standard-PCR (Polymerasekettenreaktion), gleichwohl es die Zündkapseln sich orientieren lässt in der Rückwärtsrichtung der üblichen Lagebestimmung. Die Schablone für die Rückzündkapseln ist ein Beschränkungsfragment, das nach sich verbunden worden ist, um einen Kreis zu bilden.
Die umgekehrte PCR-Methode
Die umgekehrte PCR-Methode umfaßt eine Reihe Verdauung und Selbst-verbindungen mit der DNA, die durch einen Beschränkung Endonuclease geschnitten wird. Dieser Schnitt ergibt eine bekannte Reihenfolge an jedem Ende der unbekannten Reihenfolgen.
Umgekehrte PCR-Jobstepps
1) wird Ziel DNA leicht in kleinere Fragmente einiger Kilobases durch Beschränkung Endonucleaseverdauung geschnitten.
2) wird Selbst-Verbindung unter den niedrigen Konzentrationen verursacht, die das Phosphatrückgrat veranlassen zu verbessern. Dieses gibt ein Kreis-DNA-Verbindungprodukt.
3) ist Ziel DNA dann die Beschränkung, die mit einem bekannten Endonuclease verdaut wird. Dieses legt einen Schnitt innerhalb der bekannten internen Reihenfolge fest, die ein lineares Produkt mit bekannten Terminalreihenfolgen festlegt. Dieses kann für PCR (Polymerasekettenreaktion) jetzt verwendet werden.
4) wird Standard-PCR mit den Zündkapseln geleitet, die zu den Now bekannten internen Reihenfolgen ergänzend sind.
Zusammenfassend:
Umgekehrter PCR arbeitet, um die Reihenfolgen zu klonen, die eine bekannte Reihenfolge angrenzen. Angrenzende DNA-Reihenfolgen werden und verbunden dann verdaut, um Kreis-DNA festzulegen.
Die PCR-Zündkapseln, die weg von den bekannten Reihenfolgen zeigen, werden dann eingesetzt, um die angrenzenden Reihenfolgen zu verstärken.
Anwendungen umgekehrten PCR
Umgekehrter PCR hat zahlreiche Anwendungen in der Molekularbiologie einschließlich die Verstärkung und das Kennzeichen der Reihenfolgen, die umstellbare Elemente angrenzen, und das Kennzeichen der genomic Einsätze.
Umgekehrtes PCR-Protokoll
Umgekehrte PCR-Referenzen
1. Ochman H, Gerber WIE, Hartl DL. Genetik. Nov. 1988; 120 (3): 621-3.