PCR Reinigung
PCR Reinigung-Hintergrund
Im Allgemeinen sind mehr, die Sie zuerst Ihr PCR optimieren, weniger Ihre Notwendigkeit an den zwingenden post-PCR Reinigungmethoden.
Wenn Ihre PCR Zustände gut optimiert werden, werden die meisten Ihrer addierten Zündkapseln und des Willen der dNTPs oben während der pcr Verstärkungen verwendet, so gibt es nur sehr wenige behinderende Faktoren und es kann möglich sein, das direkte Der Reihe nach ordnen durchzuführen. Wenn Sie gehen, Vor-klonen Sie Ihr PCR Fragment in einen TOPO Klonenvektor, dann müssen Sie nur ein Haupt-PCR Band haben, das auf Ihrem Gel sichtbar ist. Wenn Sie mehrfache Bänder haben, stellen Sie, Ihre PCR Zustände zuerst zu optimieren sicher.
Sehen Sie auch PCR Produkt, PCR der Reihe nach zu ordnen und zu optimieren.
PCR Produkte brauchen nicht, vor jedoch der Reihe nach ordnen gereinigt zu werden, zum der genauen der Reihe nach ordnenden Daten, es zu erhalten wird empfohlen normalerweise, herauf Ihre PCR Produkte nach Verstärkung zu säubern.
Wenn Sie übermäßige Zündkapselmengen addiert haben, oder Zündkapseln unbenutzt sind, können diese Zündkapseln als Verlängerung Zündkapseln während des Der Reihe nach ordnens dienen, und das resultiert im Erzeugung eines zusätzlichen Satzes färben-beschrifteter der Reihe nach ordnender Fragmente, die schwierig bilden können, Datendeutung der Reihe nach ordnend, wenn nicht unmöglich.
Pfosten-Reinigung PCR prducts sollten auf ein Agarosegel laufen gelassen werden, um die Qualität der Reinigung zu überprüfen. Wenn das Schmieren oder die mehrfachen Bänder anwesend sind, Produktschlupfstelle, werden Sie nicht normalerweise obatin hohe Qualitätsreihenfolge Daten.
Gelreinigung des Fragments kann mit einer niedrigen Schmelzentemperatur Agarose vollendet werden. Sie können Ihr Band unter UVLICHT mit einem Rasiermesser entfernen und extrahieren die DNA von der Scheibe mit electroelution oder Gelextraktionmethoden mit Puffern/Spalten.
PCR Reinigung für das Der Reihe nach ordnen und das Klonen
Um überschüssige dNTPs zu entfernen, unincorporated Zündkapseln und unspezifische PCR Produkte, die Sie einige Methoden verwenden können.
Qiagen PCR Reinigung-Installationssatz und andere PCR Reinigunginstallationssätze.
Sie können Zündkapseln auch entfernen und dNTPs, indem sie die PCR Produkte auf einer Agarose, gelatieren laufen lassen, die Bänder ausschneiden und DNA Extraktion vom Agarosegel mit Qiagen Gel-Reinigung-Installationssatz leiten.
Nach PCR Reinigung
Nach jeder möglicher PCR Reinigungmethode sollten Sie die Qualität und die Quantität des PCR Produktes herstellen. Sie können dies tun, indem Sie die Proben mit Agarosegel electrophoreiss zusammen mit einer DNA Konzentration Markierung laufen lassen.
Sie können die Quantität von DNA mit einem UVSPEKTROFOTOMETER auch schätzen.