Pcr-Klonen
Klonen PCR-Produkte
Wenn Sie ein Fragment von DNA in ein Plasmid oder in ein Konstruieren klonen möchten, verwendet eine der einfachsten Methoden, dies zu tun PCR. Wenn Sie das DNA-Fragment oder Gen bereits in einem Plasmid haben und die Beschränkungssites, die das Fragment angrenzen, mit dem neuen Plasmid kompatibel sind, das Sie es in klonen möchten, funktioniert Beschränkungsenzymverdauung normalerweise gut.
Jedoch wenn Sie neue Beschränkungssites für das Fragment ausführen, Auslassungen aus dem Fragment konstruieren, oder Sites innerhalb der DNA ändern möchten, ist PCR-oder Polymerasekettenreaktion des DNA-Fragments eine der einfachsten und besten Methoden, Ihr Fragment unter Verwendung PCR zu klonen.
Konzipieren der Zündkapseln für PCR-Klonen
Zündkapseln für PCR-Klonen sind normalerweise wegen der Notwendigkeit, Beschränkungssites hinzuzufügen länger.
Beschränkungssites sind normalerweise 6 BP in der Länge. Wenn Sie nicht zum subclone das PCR-Produkt gehen, müssen Sie Nukleotide 5 ' der Beschränkungssites hinzufügen
Dieses lässt das Beschränkungsenzym an binden und die Beschränkungssite schneiden, um leistungsfähiger zu sein.
Distanzscheiben-Beschränkungssite Zündkapsel-Reihenfolge (konzipiert durch Zündkapselprogramm)
3 BP --6bp 15-22 BP
PCR Subcloning
(Subclone bedeutet, das PCR-Produkt in einen Vektor zu klonen, bevor Sie ihn in Ihren Vektor des Interesses einsetzen. Vorteile von diesem umfaßt die Tatsache, dass Sie nie PCR Ihr Einsatz wieder müssen, Sie haben ihn immer im Kühlraum, und Sie können soviel wie Sie aufwachsen wünschen mit Bakterium.)
Von unserer Erfahrung PCR-Produkte ist zu schneiden normalerweise viel weniger leistungsfähig als Ausschnittfragmente aus Vektoren heraus. So PCR-Produkte können zu schneiden und das Klonen sie in Ihren Vektor möglicherweise nicht direkt sein, dem leistungsfähig und Sie Mühe haben können, dies zu tun.
Die ist die Methode, die in einen subcloning Vektor subcloning ist, ist normalerweise am besten.
Topo-Vektoren
Topo-Vektoren sind für das Subcloning groß, obgleich sie teuer sein können. Sie sichern Sie Zeit langfristig, und bilden Klonen PCR-Produkte einfacher und leistungsfähiger.
Der Grund für dieses ist, dass Sie DNA in einem Plasmid leicht verdauen können. Er ist für das Beschränkungsenzym leistungsfähiger, da er an leicht binden und Ihr Stück verdauen kann.
Nachteile sind, dass Sie die leistungsfähigen und optimierten PCR-Zustände haben müssen. Das Vorhandensein vieler Bänder in Ihrem PCR bildet es schwierig, wenn nicht unmöglich, Ihr PCR-Produkt des Interesses zu klonen.
Sie können normalerweise subclone Ihr PCR-Produkt innerhalb ungefähr 2 Tage. Verbindung nimmt nur 5 Minuten und Sie können Ihre bakteriellen Kolonien der Tag der Verbindung überziehen. Sobald Sie Kolonien der Next day auswählen und sie in den Media wachsen, verstärken Sie nicht nur Ihren Einsatz, Sie auch haben jetzt eine bakterielle Kolonie Ihres subcloned Einsatzes, die Sie mit Glyzerin in den flüssigen Stickstoff für Jahre einfrieren können.
Dieses hilft wirklich, wenn Sie ein anderes Konstruieren mit Ihrem Einsatz bilden müssen!