PCR-ENZYME: Pcr-Polymerasen

Pcr-Polymerasen - die entscheidende Anleitung

Pcr-Polymerasen: Eine Einleitung

Die Wahl der DNA-Polymerase, die durch PCR eingesetzt wird, wird durch die Ziele des Experimentes festgestellt. Es gibt jetzt eine Fülle handelsübliche Enzyme, zum von diesem zu wählen sich unterscheiden in ihrer Wärmebeständigkeit, in processivity und in Treue. Das allgemein verwendetste und weitgehend studierte Enzym ist Taq DNA-Polymerase.

Anfangs-PCR-Polymerasen

Die DNA-Polymerasen, die ursprünglich in den ersten PCR-Reaktionen benutzt wurden, wurden vom Bakterium Escherichia Coli extrahiert. Obgleich dieses Enzym war, verwendet ein unschätzbares Hilfsmittel für viele Molekularbiologieforschung in der Vergangenheit und sogar heute, hatte es viele Nachteile im ursprünglichen PCR. In PCR muss die pcr-Reaktion denaturiert werden, indem man das double-stranded DNA-Produkt nach jeder Schleife erhitzt. Leider auch erhitzend inaktivierte irreversibel die Escherichia Coli DNA-Polymerase. Neue Aliquoten des Enzyms mussten beim Anfang jeder Schleife manuell hinzugefügt werden. Mit 30-40 Schleifen von PCR, war dieses eine sehr mühsame und langweilige Aufgabe.

Was benötigt wurde, waren eine DNA-Polymerase, dass geblieben beständig während des DNA-Denaturierungjobsteps, der an 90°C durchgeführt wurde oder schütteln sich. Eine Entdeckung bildete die Lösung viel einfacher. Das Bakterium thermophile aquaticus wurde von den heißen Frühlingen des Wassers lokalisiert. Dieses Bakterium war überlebt und sich stark vermehrt in den extrem Hochwassertemperaturen der heißen Frühlinge in der Lage. Lokalisierung der DNA-Polymerase von diesem Bakterium erbrachte eine PCR-Polymerase, die nicht schnell an den Hochtemperaturen inaktiviert wurde. Gelfand et al. an der Cetus Korporation erfolgreich reinigte und klonte diese PCR-Polymerase jetzt benannte Taq (thermophiles aquaticus kurz gesagt) Polymerase.

Dieses gewährte 30-40 Schleifen der ohne die Notwendigkeit durchgeführt zu werden PCR-Verstärkung, das PCR-Reaktionsgefäß zu öffnen und frische Polymerase hinzuzufügen. Diese auch verringerte mögliche Verschmutzung, die eingeführt werden könnte, als, Polymerase über 20-30 manuell hinzufügend, setzt in den ursprünglichen PCR-Reaktionen Zeit fest. Auch wegen der Beschaffenheit des thermophilen Bakteriums und der Polymerase, Taq arbeitete optimal bei den Temperaturen um 72°C und erlaubte, dass DNA-Synthese an viel höher durchgeführt wird
Temperaturen, als möglich mit dem Escherichia- Colienzym war. Dieses hatte den Vorteil des Erlaubens, dass der Schablone DNA-Strang an einer viel Highfidelity wegen des höheren strigency des PCR-Zündkapselausglühens kopiert wird. Dieses weitere verringerte unspezifische Produkte, die viele früheren PCR-Reaktionen beeinflußt hatten.

TAQ DNA-Polymerase

Taq Polymerase auch einfach genanntes „Taq“, ist eine hitzebeständige DNA-Polymerase, die in der Polymerasekettenreaktion (PCR) benutzt wird um die DNA-Wiederholungreaktion in der PCR-Schleife zu katalysieren. In dieser Weise der Verstärkung, ist PCR in der Lage, für das Vorhandensein oder das Fehlen einem Gen des Interesses an einer biologischen Probe zu überprüfen.

Taq DNA-Polymerase

Molekulares Modell der Taq DNA-Polymerase. Kristallstruktur der Taq DNA-Polymerase zeigt eine neue Lagebestimmung für das Struktur-Spezifische Nuklease-Gebiet.

Taq DNA-Polymerase ersetzte Escherichia Coli DNA-Polymerase in PCR, wegen seiner hitzebeständigen Eigenschaften. Taq wurde zuerst vom Thermus aquaticus, ein Bakterium lokalisiert, das in den heißen Frühlingen und in den hydrothermalen Entlüftungsöffnungen lebt.

Taq war die erste Polymerase, die war, der Denaturierung zu widerstehen bedingt (über dem °C) 90 benötigt während des PCR-Radfahrens.

Taq hat eine e-nzymatic Halbwertzeit an 95°C von ungefähr 40 Min. Für mehr Eigenschaften von Taq, sehen Sie die Tabelle unten.

Einer von Hauptnachteilen der Taq Polymerasen ist seine niedrige Wiederholungtreue. Da Taq exonuclease 3 ' nicht bis 5 ' hat, Mechanismus zu lesen, um eine versehentliche Nichtübereinstimmung im eben synthetisierten DNA-Strang zu ersetzen, produziert Taq mehr Fehler als, der Polymerasen wie Pfu Korrektur lesend.

Taq DNA-Polymerase ist auch dadurch eindeutig, dass sie PCR-Produkte mit Überhängen a-(Adenin) produziert. Dieses wurde gefunden, um ziemlich nützlich zu sein und wurde ausgenutzt, um TA-Klonen und TOPO-Klonen (Invitrogen) zu produzieren. Diese Methoden setzen einen Klonenvektor ein (oder Plasmid) der Überhänge t-(Thymine) besitzt. Dieses erlaubt Verbindung unter Verwendung mit den a-Überhängen des PCR-Produktes des schnell vollendet zu werden topoisomerase oder DNAligase,

PFU DNA-Polymerase

Pfu DNA-Polymerase ist ein Enzym, das im hyperthermophilen archaeon Pyrococcus furiosus gefunden wird, in dem sie in vivo arbeitet, um DNA des Organismus zu wiederholen. In vitro wird Pfu verwendet, um DNA in der Polymerase-Kettenreaktion schnell zu verstärken, in der das Enzym die zentrale Funktion der Kopie eines neuen Stranges von DNA während jedes Extensionsjobsteps dient.

Überlegenheit der Pfu Polymerase der Hauptunterschied zwischen Pfu und alternativen Enzymen ist Pfus überlegene Hitzebeständigkeit und „Korrekturlesen“ der Eigenschaften, die mit anderen hitzebeständigen Polymerasen verglichen werden. Anders als Taq DNA-Polymerase besitzt Pfu DNA-Polymerase das exonuclease 3 ' bis 5 ', das Aktivität liest und bedeutet, dass es seine Methode entlang der DNA vom Ende die 3 ' Ende bis 5 ' funktioniert und Nukleotid-misincorporation Fehler behebt. Dies heißt, dass Pfu DNA Polymerase-festgelegte PCR-Fragmente wenige Fehler als Taq-festgelegte PCR-Einsätze haben. Infolgedessen wird Pfu häufiger für molekulares Klonen der PCR-Fragmente als das historisch populäre Taq verwendet. Handelsübliches Pfu ergibt gewöhnlich eine Fehlerhäufigkeit von 1 in 1.3 Million niedrigen Paaren und kann 2.6% veränderte Produkte erbringen, wenn er Fragmente 1kb unter Verwendung PCR verstärkt. Jedoch ist Pfu langsamer und benötigt gewöhnlich 1-2 Minuten, um 1kb von DNA an 72° C. zu verstärken. Unter Verwendung Pfu ergibt DNA-Polymerase in den PCR-Reaktionen auch stumpf-beendete PCR-Produkte. Pfu DNA-Polymerase ist folglich Vorgesetztes für Techniken, die high-fidelity DNA-Synthese benötigen, aber kann in Verbindung mit Taq Polymerase auch verwendet werden, um die Treue von Pfu mit der Geschwindigkeit der Taq Polymeraseaktivität zu erreichen.

Geschichte

Wissenschaftler verbanden mit der Biotech-Firma Stratagene, angesiedelt in La Jolla, Kalifornien entdeckten die Überlegenheit von Pfu über Taq 1991. Sie veröffentlichten ihre Arbeit im Journal Gen im Dezember dieses Jahres (Gen. 12. Dezember 1991; 108 (1): 1-6). US Patent 5.489.523 wurde über exonuclease-unzulänglichem Pfu bewilligt, im Februar 1996 während US-Patent 5.545.552 über Pfu selbst im August 1996 bewilligt wurde.

Pcr-Polymerasen

Zusammenfassung der vorhandenen PCR-Polymerasen und ihrer Eigenschaften.

DNA-Polymerase	Biologische Quelle	5 '--3 ' Exonuclease Aktivität	3 '--5 ' Exonuclease Aktivität	Halbwertzeit 95°C (Minute)	Handelsnamen	Angebende Firmen	Extensions-Kinetik (nucleosides/s)	Fehlerhäufigkeit	Zeit (S) zu 1kb (72°C)
Taq	Thermus Aquaticus	+	-	40	AmpliTaq, AmpliTaq Gold	Promega, Roche, Invitrogen und viele andere.	75	1 in 10^3	32
Pfu	Pyrococcus furiosus	-	+	120	PfuTurbo	Stratagene, Fermentas, Invitrogen unter anderem	60	1 in 1.3 x 10^6	60-120
Pwo	Pyrococcus woesei	-	+	N/A			N/A	N/A	N/A
Tfl	Thermas Flavus	-	-
rTth	Themus thermophil	+	-	20
Tli	Thermus litoris	-	+	400	Entlüftungsöffnung
Tma	Thermotoga maritima	-	+	>50

PCR und Polymerasen

PCR ist an DNA größere als 10 Kilobases durchgeführt worden, gleichwohl der durchschnittliche PCR nur mehreree hundert zu einigen tausend Unterseiten von DNA ist. Das Problem mit langem PCR ist, dass es eine Balance zwischen Genauigkeit und processivity des Enzyms gibt. Normalerweise das länger das Fragment, das größer die Wahrscheinlichkeit von Fehlern.

Typen von PCR

Pcr-Betriebsmittel