Pcr-Störungssuche
Pcr-Probleme und Lösungen, PCR-Hilfe
Was Ihr PCR-Problem? ist:
Lange unspezifische PCR-Produkte?
Problem:
Lange unspezifische Produkte in PCR
Wenn Sie ein Agarosegel laufen lassen, beschmutzen Sie größere unspezifische PCR-Bänder, die nicht sortieren das rechte sind.
Lösungen zu den langen unspezifischen Produkten in PCR:
Verringern Sie Glühdauer
Verringern Sie Extensionszeit
Verringern Sie Extensionstemperatur auf 62-68º C
Erhöhen Sie Konzentration des KCl (Buffer) auf 1.2x-2x, aber halten Sie MgCl2konzentration bei 1.5-2mM
Erhöhen Sie, MgCl2konzentration bis 3-4.5 Millimeter aber halten Sie dNTP Konzentrationskonstante.
Benutzen Sie weniger Zündkapsel
Nehmen Sie weniger DNA-Schablone
Nehmen Sie weniger Taq Polymerase
Wenn keine der oben genannten Arbeiten: überprüfen Sie die Zündkapsel auf sich wiederholenden Reihenfolgen (BÖE richten die Reihenfolge mit den Datenbanken) aus und ändern Sie die Zündkapseln
Kombination von einigem/alles oben.
Problem:
Pcr-Zündkapsel-Dimer
Wenn Sie ein Agarosegel laufen lassen, beschmutzen Sie einige sehr kleine PCR-Bänder. Diese sind die Größe Ihrer Zündkapsel oder über die Größe beider Ihrer Zündkapseln (A und B) zusammen. Diese werden „als Zündkapseldimer“ bezeichnet und werden durch das Ausglühen Ihrer Zündkapsel mit sich oder mit der anderen Zündkapsel gebildet.
Lösungen zu den Zündkapseldimern in PCR:
Benutzen Sie weniger Zündkapsel.
Neukonstruktionzündkapsel und bestellen einen neuen Stapel. Stellen Sie Sie Software und Überprüfung des Gebrauchzündkapselentwurfs auf Selbst-ausglühen sicher und dass die Zündkapseln nicht einen großen Prozentsatz der ergänzenden Reihenfolge teilen. Überprüfen Sie Zündkapseln sorgfältig auf Homodimer und Heterodimer Anordnung mit OligoAnalyzer
Leiten Sie PCR mit und ohne Formamid.
Titrieren Sie Mg2+ (MgCl - 1.5, 2.0, 2.5 und 3.0 Millimeter) Konzentration.
Erhöhen Sie DNA-Schablonenmenge (Konzentration).
Erhöhen Sie Ausglühentemperatur (den Versuch, der unter Verwendung einer Steigung PCR-Maschine optimiert, um optimale Temperatur für Ausglühen zu finden).
Versuchen Sie, DMSO bis zu 5% hinzuzufügen.
Versuchen Sie, HotStart PCR anstelle von regelmäßigem Taq Polymerase PCR zu verwenden.
Kombination von einigem/alles oben.