RT-PCR
Heben Sie Übertragung-Polymerase-Kettenreaktion auf
Rückübertragungpolymerasekettenreaktion (RT-PCR) basiert auf der Polymerasekettenreaktion (PCR). Wichtiger basiert sie auf dem Prozess der Rückübertragung, dem Rückseite RNS in DNA überträgt und zuerst von den Retroviruses lokalisiert wurde.
Die Techniken von RT-PCR erlaubt die Anordnung des cDNA (ergänzend oder der Exemplar DNA) von der RNS, die die Reihenfolge von RNS (wie Kurier RNS, mRNA) in der beständigeren Form der Nukleinsäure speichert, DNA. Diese Rückübertragung von der RNS in seine Rückergänzung DNA (cDNA) ist der erste Jobstepp eines normalerweise zweistufigen Prozesses von RT-PCR. Außerdem indem es die RNS in DNA kopiert, kann man die cDNA Reihenfolge dann verstärken, indem es die Zündkapseln verwendet, die für die DNA-Reihenfolge spezifisch sind. Diese Verstärkung ist der abschließende zweite Hauptjobstep des zweistufigen Prozesses von RT-PCR.
Der Prozess von RT-PCR
Der erste Jobstepp von RT-PCR gekennzeichnet als die „erste Strangreaktion“. In der Erststrang Reaktion wird ergänzendes DNA auch genanntes cDNA, von der Kurier RNS-Schablone des Interesses unter Verwendung Oligo Papierlösekorotrones (die Oligonucleotidepoly-dts Tat ähnlich Zündkapseln und Bindung bis die 3 ' die polyAreihenfolge gelegen an den 3 ' UTR - unübersetzte Region, die in den meisten mRNAs anwesend sind), dNTPs gebildet, und eine RNS-abhängige DNA-Polymerase, heben transcriptase, durch den Prozess der Rückübertragung auf.
Diese Faktoren werden in einem Rücktranscriptase Buffer 1 Stunde lang an 37°C. kombiniert. Nachdem Rücktranscriptase Reaktion komplett ist und das cDNA synthetisiert worden ist, wird RNaseH hinzugefügt (ein RNS-Verdauungenzym) das die RNS weg von dem RNS-cDNA Mischling verdaut. Nach Ausbrütung mit RNaseH, wird Standard-PCR oder Polymerasekettenreaktion unter Verwendung der DNA-Oligo Zündkapseln geleitet, die für die Reihenfolge des Interesses spezifisch sind. Dieser zweite Jobstepp gekennzeichnet als die „zweite Strangreaktion“.
So indem sie die hitzebeständige DNA-Polymerase hinzufügen, wird aufwärts und abwärts gerichtete DNA-Zündkapseln, die einzelne angeschwemmte DNA das Doppelte, das angeschwemmt wird und wird verstärkt und erlaubt die Abfragung der sogar seltenen oder niedrigen Exemplar mRNA-Reihenfolgen, indem sie seine ergänzende DNA verstärken.
Anwendungen von RT-PCR
Die exponentiale Verstärkung der ergänzenden Reihenfolge von mRNA oder DIE RNS-Reihenfolgen über Rückübertragungpolymerasekettenreaktion lassen eine hohe Empfindlichkeitsabfragungstechnik zu, in der niedrige Exemplarzahl oder weniger reichlich vorhandene RNS-Moleküle entdeckt werden können. Sie wird auch verwendet, um mRNA-Reihenfolgen in Form von ergänzender DNA zu klonen und erlaubt, dass Bibliotheken von cDNA (cDNA Bibliotheken) hergestellt werden, die alle mRNA-Reihenfolgen der Gene enthalten, die in einer Zelle ausgedrückt werden. Außerdem erlaubt sie die Kreation des cDNA Konstruierens, die durch RT-PCR geklont und den Ausdruck der Gene auf den RNS- und Proteinniveaus für weitere Studie erlauben wurden.