Καυτό pcr έναρξης - αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσεων
HotStart.
Καυτό pcr έναρξης: Μια εισαγωγή
Καυτό pcr έναρξης επιτρέπει την παρεμπόδιση της δραστηριότητας πολυμεράσεων κατά τη διάρκεια pcr της προετοιμασίας αντίδρασης. Με τον περιορισμό της δραστηριότητας πολυμεράσεων πριν από pcr την ανακύκλωση, καυτό pcr έναρξης μειώνει τη μη συγκεκριμένη ενίσχυση και αυξάνει pcr την παραγωγή στόχων προϊόντων.
Καυτό pcr έναρξης εκτελείται συνήθως με τη χρησιμοποίηση των συμπεριλαμβανόμενων χημικών τροποποιήσεων, των μεθόδων κερί-εμποδίων, και της παρεμπόδισης από ένα ταq-κατευθυνμένο αντίσωμα.
Pcr ή η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσεων χρησιμοποιεί τις πολυμεράσεις DNA που απομονώθηκαν από τους thermostable οργανισμούς όπως το ένζυμο Taq, ένας eubacterial τύπος Ι πολυμεράση DNA, και Pfu, μια archaeal πολυμεράση DNA τύπων β.
Pcr ενισχύει το DNA από τους πολλαπλάσιους κύκλους του λειώνοντας DNA στην υψηλή θερμοκρασία, ανοπτώντας τους εγχυτήρες σε μια χαμηλότερη θερμοκρασία, και επιτρέποντας έπειτα την επέκταση πολυμεράσεων σε μια ενδιάμεση θερμοκρασία. Δυστυχώς, αυτές οι thermophilic πολυμεράσεις DNA παρουσιάζουν πολύ μικρή αλλά μετρήσιμη δραστηριότητα πολυμεράσεων στη θερμοκρασία δωματίου κατά τη διάρκεια της συνέλευσης του πειράματος.
Αυτή η ανεπαρκής δραστηριότητα πολυμεράσεων DNA θα καταλύσει την επέκταση οποιωνδήποτε ανοπτημένων 3 "ακρών. Μετά από pcr την ενίσχυση, το προκύπτον προϊόν περιέχει ένα μίγμα συγκεκριμένων και μη συγκεκριμένων ζωνών. Επιπλέον, τα 5'-3 "δραστηριότητα exonuclease του DNA polymerasel υποβιβάζουν οποιεσδήποτε ελεύθερες 5" άκρες των μερικώς ανοπτημένων νουκλεϊνικών οξέων, που καταστρέφουν τα υποστρώματα εγχυτήρων και προτύπων της αντίδρασης πολυμεράσεων. Αυτό οδηγεί σε μια χαμηλότερη παραγωγή του επιθυμητού pcr προϊόντος.
Καυτό pcr έναρξης: Δημοσιεύσεις
Θερμότητα activatable 3'-τροποποιημένο dNTPs: σύνθεση και εφαρμογή για καυτό pcr έναρξης. Σχετικά άρθρα
Θερμότητα activatable 3'-τροποποιημένο dNTPs: σύνθεση και εφαρμογή για καυτό pcr έναρξης.
Νουκλεϊνικά οξέα Symp Ser (Oxf). 2008;(52):259-60
Συντάκτες: Koukhareva Ι, Haoqiang χ, Yee j, Shum j, Paul N, Hogrefe ri, Lebedev AV
Διάφορα παράγωγα 3'-αιθέρα και 3'-εστέρα των 5'-τριφωσφορικών αλάτων 2'-deoxyribonucleoside (dNTPs) προετοιμάστηκαν. Αυτά τα παράγωγα dNTP δεν ήταν υποστρώματα για την πολυμεράση DNA και δεν υποστήριξαν την επέκταση εγχυτήρων στη θερμοκρασία δωματίου. Εντούτοις, με απότομα να προθερμάνουν σε 95 βαθμούς γ pcr στον απομονωτή, αυτά τα 3'-τροποποιημένα dNTPs μπορούν να μετατραπούν στην αντιστοιχία χωρίς τροποποιήσεις φυσικό dNTPs που υποστηρίζουν αποτελεσματικά pcr την ενίσχυση. Η ανάλυση pcr των προϊόντων που λήφθηκε με 3'-τροποποιημένο dNTPs αποκάλυψε μια σημαντική βελτίωση pcr στην απόδοση με συνέπεια την υψηλότερη παραγωγή amplicon και μείωσε το σχηματισμό των προϊόντων από-στόχων (ΠΣΔ-ΕΜΠΎΡΕΥΜΑ και dimer εγχυτήρων). Μεταξύ του μελετημένου 3'-τροποποιημένου dNTPs, τα παράγωγα 3'-tetrahydrofuranyl παρουσίασαν καλύτερα αποτελέσματα.
PMID: 18776352 [ PubMed - στη διαδικασία ]