Αντίστροφο pcr

Αντίστροφο pcr υπόβαθρο

Αντίστροφο pcr κάλεσε επίσης IPCR, και περιγράφηκε αρχικά από Ochman et το Al το 1988 (1).

Ένας περιορισμός τυποποιημένο pcr είναι ότι 5 "και 3" περιοχές πλαισίωσης του τεμαχίου DNA ενδιαφέροντός σας πρέπει να μαθευτούν. Αντίστροφο pcr επιτρέπει σε σας για να διευθύνει pcr όταν έχετε μόνο τις πληροφορίες μιας εσωτερικής ακολουθίας.

Η αντίστροφη αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσεων είναι μια παραλλαγή pcr, και χρησιμοποιείται όταν είναι γνωστή μόνο μια εσωτερική ακολουθία του DNA στόχων. Είναι επομένως πολύ χρήσιμο στον προσδιορισμό των ακολουθιών DNA πλαισίωσης genomic ενθέτων. Παρόμοιο με άλλες pcr μεθόδους, αντίστροφο pcr ενισχύει το DNA στόχων χρησιμοποιώντας την πολυμεράση DNA.

Αντίστροφο pcr χρησιμοποιεί τυποποιημένο pcr (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσεων), εντούτοις προσανατολίζει τους εγχυτήρες στην αντίστροφη κατεύθυνση του συνηθισμένου προσανατολισμού. Το πρότυπο για τους αντίστροφους εγχυτήρες είναι ένα τεμάχιο περιορισμού που έχει επιδεθεί επάνω σε το για να διαμορφώσει έναν κύκλο.

Η αντίστροφη pcr μέθοδος

Η αντίστροφη pcr μέθοδος περιλαμβάνει μια σειρά πέψεων και μόνος-ληγατηονς με το DNA που κόβεται από μια ενδονουκλεάση περιορισμού. Αυτή η περικοπή οδηγεί σε μια γνωστή ακολουθία σε καθένα τέλος των άγνωστων ακολουθιών.

Αντίστροφα pcr βήματα

1) Το DNA στόχων κόβεται ελαφριά στα μικρότερα τεμάχια διάφορων κιλοβάσεων από την πέψη ενδονουκλεάσεων περιορισμού.
2) Το μόνος-ληγατηον προκαλείται κάτω από τις χαμηλές συγκεντρώσεις αναγκάζοντας τη σπονδυλική στήλη φωσφορικού άλατος για να μεταρρυθμίσει. Αυτό δίνει ένα κυκλικό ligation DNA προϊόν.
3) Το DNA στόχων είναι έπειτα περιορισμός που αφομοιώνεται με μια γνωστή ενδονουκλεάση. Αυτό παράγει μια περικοπή μέσα στη γνωστή εσωτερική ακολουθία που παράγει ένα γραμμικό προϊόν με τις γνωστές τελικές ακολουθίες. Αυτό μπορεί τώρα να χρησιμοποιηθεί για pcr (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσεων).
4) Τυποποιημένο pcr διευθύνεται με τους εγχυτήρες συμπληρωματικούς στις τώρα γνωστές εσωτερικές ακολουθίες.

Εν περιλήψει:

Αντίστροφες pcr λειτουργίες στις ακολουθίες κλώνων που πλαισιώνουν μια γνωστή ακολουθία. Οι ακολουθίες DNA πλαισίωσης αφομοιώνονται και επιδένονται έπειτα για να παραγάγουν το κυκλικό DNA.

Pcr οι εγχυτήρες που δείχνουν μακρυά από τις γνωστές ακολουθίες υιοθετούνται έπειτα για να ενισχύσουν τις ακολουθίες πλαισίωσης.

Εφαρμογές αντίστροφο pcr

Αντίστροφο pcr έχει τις πολυάριθμες εφαρμογές στη μοριακή βιολογία συμπεριλαμβανομένης της ενίσχυσης και του προσδιορισμού των ακολουθιών πλαισιώνοντας τα μετατρέψιμα στοιχεία, και τον προσδιορισμό των genomic ενθέτων.