Pcr κλωνοποίηση
Pcr κλωνοποίησης προϊόντα
Εάν θέλετε να κλωνοποιήσετε ένα τεμάχιο του DNA σε ένα πλασμίδιο ή ένα κατασκεύασμα, ένας από τους ευκολότερους τρόπους να γίνει αυτό χρησιμοποιεί pcr. Εάν έχετε το τεμάχιο ή το γονίδιο DNA ήδη σε ένα πλασμίδιο, και οι περιοχές περιορισμού που πλαισιώνουν το τεμάχιο είναι συμβατές με το νέο πλασμίδιο θέλετε να το κλωνοποιήσετε, η ενζυμική πέψη περιορισμού λειτουργεί συνήθως καλά.
Εντούτοις, εάν θέλετε να κατασκευάσετε τις νέες περιοχές περιορισμού για το τεμάχιο, κατασκευάζετε τις διαγραφές του τεμαχίου, ή αλλοιώνετε τις περιοχές μέσα στο DNA, pcr ή η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσεων του τεμαχίου DNA είναι ένας από τους ευκολότερους και καλύτερους τρόπους να κλωνοποιηθεί το τεμάχιό σας που χρησιμοποιεί pcr.
Σχεδιασμός των εγχυτήρων για pcr την κλωνοποίηση
Οι εγχυτήρες για pcr την κλωνοποίηση είναι συνήθως μακρύτεροι λόγω της ανάγκης να προστεθούν οι περιοχές περιορισμού.
Οι περιοχές περιορισμού είναι συνήθως σημείο ζέσεως 6 στο μήκος. Εάν δεν πηγαίνετε στο subclone το pcr προϊόν, πρέπει να προσθέσετε τις νουκλεοτίδες 5 "της περιοχής περιορισμού
Αυτό επιτρέπει στο ένζυμο περιορισμού για να δεσμεύσει και να κόψει την περιοχή περιορισμού για να είναι αποδοτικότερο.
Ακολουθία εγχυτήρων περιοχών περιορισμού πλήκτρων διαστήματος (που σχεδιάζεται από το πρόγραμμα εγχυτήρων)
3 σημείο ζέσεως -- 6bp -- σημείο ζέσεως 15-22
Pcr Subcloning
(Subclone σημαίνει να κλωνοποιήσει το pcr προϊόν σε ένα διάνυσμα προτού να το παρεμβάλετε στο διάνυσμα ενδιαφέροντός σας. Τα πλεονεκτήματα αυτού περιλαμβάνουν το γεγονός ότι δεν πρέπει ποτέ pcr το ένθετό σας πάλι, θα το έχετε πάντα στο ψυγείο, και μπορείτε να μεγαλώσετε τόσο πολύ όπως θέλετε τα βακτηρίδια.)
Από την εμπειρία μας, τα τέμνοντα pcr προϊόντα είναι συνήθως πολύ λιγότερο αποδοτικά από τα τέμνοντα τεμάχια από τα διανύσματα. Κατά συνέπεια, pcr κοπής τα προϊόντα και κλωνοποίηση τους στο διάνυσμά σας μπορούν άμεσα να μην είναι ότι αποδοτικοί και μπορείτε να έχετε το πρόβλημα κάνοντας αυτό.
Αυτό είναι τρόπων σε ένα subcloning διάνυσμα είναι συνήθως καλύτερο.
Διανύσματα TOPO
Τα διανύσματα TOPO είναι μεγάλα για, αν και μπορούν να είναι ακριβά. Σας κερδίζουν χρόνο μακροπρόθεσμα, και καθιστούν pcr κλωνοποίησης τα προϊόντα ευκολότερα και αποδοτικότερα.
Ο λόγος για αυτό είναι ότι μπορείτε εύκολα να αφομοιώσετε το DNA σε ένα πλασμίδιο. Είναι αποδοτικότερο για το ένζυμο περιορισμού δεδομένου ότι μπορεί εύκολα να δεσμεύσει και να αφομοιώσει το κομμάτι σας.
Τα μειονεκτήματα είναι ότι πρέπει να έχετε τους αποδοτικούς και βελτιστοποιημένους pcr όρους. Η παρουσία πολλών ζωνών pcr σας θα το καταστήσει δύσκολο εάν μη αδύνατη να κλωνοποιήσει pcr το προϊόν ενδιαφέροντός σας.
Μπορείτε συνήθως subclone pcr σας το προϊόν περίπου μέσα σε 2 ημέρες. Ligation διαρκεί μόνο 5 λεπτά και μπορείτε να καλύψετε τις βακτηριακές αποικίες σας η ημέρα ligation. Μόλις επιλέξετε τις αποικίες η επόμενη ημέρα και τις αυξηθείτε στα μέσα, όχι μόνο ενισχύετε το ένθετό σας, επίσης τώρα έχετε μια βακτηριακή αποικία του σας το ένθετο που μπορείτε να παγώσετε με τη γλυκερίνη στο υγρό άζωτο για χρόνια.
Αυτό βοηθά πραγματικά όταν πρέπει να κάνετε ένα άλλο κατασκεύασμα με το ένθετό σας!