Polimerización en cadena in situ
Definición de la polimerización en cadena in situ
La polimerización en cadena in situ (ISH) es una reacción en cadena de polimerasa que ocurre realmente dentro de la célula en una diapositiva. La amplificación in situ de la polimerización en cadena se puede realizar en tejido o las células fijo.
Introducción in situ de la polimerización en cadena
Durante el lanzamiento y la progresión de la enfermedad, las cantidades minuciosas de un producto en pequeñas poblaciones de células o los tejidos pueden ser vitales para la patogenesia de la enfermedad.
En muchas enfermedades de lento-desarrollo que requieren meses o aún años para manifestarse clínico, se ha mostrado que la mayoría de la población afectada de la célula está en un estado transcriptionally inactivo, y en un nivel de un gene por la célula huesped.
Los métodos y la reacción en cadena de polimerasa (polimerización en cadena) del hibridación del ácido nucléico ambos se han empleado para examinar la expresión y la detección de tales genes afectados durante la patogenesia. Mientras que ambas estas técnicas son absolutamente útiles, la desventaja de estas técnicas es que esencialmente están conduciendo estudios de la expresión y de población de la célula. Los ácidos nucléicos se aíslan de una población de células que contenga un suficiente número de moléculas para detectar directamente por técnicas estándar del hibridación, o, cuando una subpoblación contiene tan poco como una sola copia del ácido nucléico, de esa molécula amplificada por la polimerización en cadena, y detectada después de la amplificación.
El hibridación in situ (ISH) aplica la metodología de la técnica del hibridación del ácido nucléico al nivel celular. Combinar la citoquímica y la polimerización en cadena immunocytochemistry, in situ permite que la identificación de etiquetas de plástico celulares sea identificada, y permite más lejos la localización a las secuencias específicas de la célula dentro de poblaciones de la célula, tales como tejidos y muestras de sangre.
La polimerización en cadena in situ se limita a la detección de material non-genomic tal como ARN, genes o genomas, pues el límite de detección en la mayoría de las condiciones es varias copias del ácido nucléico de la blanco por la célula. Por lo tanto, debido a las limitaciones del número de copia, hibridación del ARN es más sensible que la detección de la DNA.
Los factores que afectan a sensibilidad in situ de la polimerización en cadena incluyen:
1) el strandedness de la molécula de la blanco
2) la carencia de una secuencia complementaria próxima a las secuencias de la blanco
Invierta la transcripción in situ transcriptase-catalizada incluso se ha utilizado para detectar RNAs que ocurren en el número de copia relativamente alto.
Polimerización en cadena in situ (ISH) Protcol
La estequiometría de los componentes de ácido nucléico hace inicialmente la reacción cartilla-conducida. Mientras que procede la reacción sin embargo, el producto sí mismo de la polimerización en cadena comienza a funcionar como una blanco para la amplificación adicional, así como una cartilla para el alargamiento adicional. Es la acumulación de secuencias alargadas en reacciones múltiples que es conservada por la célula fija y actúa como la blanco para la punta de prueba radiactiva en la fase de la detección.
La naturaleza física compleja dentro de una célula fija impide la eficacia de la polimerasa así como la difusión y el recocido, y los tiempos del alargamiento son así mucho más largos que ésos conducidos bajo condiciones acuosas (polimerización en cadena estándar). La señal óptima producted generalmente usando un alargamiento minucioso 15.