PCR Inverso
Fondo Inverso de PCR
PCR inverso también llamó a IPCR, y primero fue descrito por Ochman et el al. en 1988 (1).
Una limitación de PCR estándar es que las regiones que
flanquean 5' y 3' de su fragmento de la DNA del interés deben ser
sabidas. PCR inverso permite que usted conduzca PCR cuando usted
tiene solamente la información de una secuencia interna.
La reacción en cadena inversa de la polimerasa es una variante de PCR, y se utiliza cuando solamente una secuencia interna de la DNA de la blanco se sabe. Es por lo tanto muy útil en identificar secuencias de la DNA que flanquean de rellenos genomic. Similar a otros métodos de PCR, PCR inverso amplifica la DNA de la blanco usando la polimerasa de la DNA.
PCR inverso utiliza PCR estándar (reacción en cadena
de la polimerasa), no obstante hace las cartillas orientar en la
dirección contraria de la orientación generalmente. La
plantilla para las cartillas reversas es un fragmento de la
restricción que se ha ligado sobre sí mismo para formar un círculo.
El Método Inverso de PCR
El método inverso de PCR incluye una serie de digestiones y de uno mismo-ligaduras con la DNA que es cortada por un endonuclease de la restricción. Este corte da lugar a una secuencia sabida en cualquier final de secuencias desconocidas.
Pasos Inversos de PCR
1) la DNA de la blanco es cortada ligeramente en
fragmentos más pequeños de varios kilobases por la digestión del
endonuclease de la restricción.
2) la Uno mismo-ligadura se induce bajo concentraciones bajas
que hacen la espina dorsal del fosfato reformar. Esto da un
producto circular de la ligadura de la DNA.
3) la DNA de la blanco es entonces restricción digerida con un
endonuclease sabido. Esto genera un corte dentro de la secuencia
interna sabida que genera un producto linear con secuencias terminales
sabidas. Esto se puede ahora utilizar para PCR (reacción en
cadena de la polimerasa).
4) PCR estándar se conduce con las cartillas complementarias a
las secuencias internas ahora sabidas.
En resumen:
PCR inverso funciona para reproducir las secuencias que flanquean una secuencia sabida. Las secuencias de la DNA que flanquean se digieren y después se ligan para generar la DNA circular.
Las cartillas de PCR que señalan lejos de las secuencias
sabidas entonces se emplean para amplificar las secuencias que
flanquean.
Usos de PCR inverso
PCR inverso tiene los usos numerosos en biología molecular incluyendo la amplificación y la identificación de las secuencias que flanquean elementos transposable, y la identificación de rellenos genomic.
Protocolo Inverso de PCR
Referencias Inversas de PCR
1. Ochman H, Gerber COMO, Hartl DL. Genética. 1988 Nov;120(3):621-3.