Reproducción de la polimerización en cadena
Productos de la polimerización en cadena de la reproducción
Si usted quiere reproducir un fragmento de la DNA en un plásmido o una construcción, una de las maneras más fáciles de hacer esto está utilizando la polimerización en cadena. Si usted tiene el fragmento o gene de la DNA ya en un plásmido, y los sitios de la restricción que flanquean el fragmento son compatibles con el nuevo plásmido que usted quiere reproducirlo en, la digestión de la enzima de la restricción trabaja generalmente bien.
Sin embargo, si usted quiere dirigir los nuevos sitios de la restricción para el fragmento, construir las cancelacínes del fragmento, o transformar sitios dentro de la DNA, la reacción en cadena de la polimerización en cadena o de polimerasa del fragmento de la DNA es una de las maneras más fáciles y mejores de reproducir su fragmento usando la polimerización en cadena.
Diseño de las cartillas para la reproducción de la polimerización en cadena
Las cartillas para la reproducción de la polimerización en cadena son generalmente más largas debido a la necesidad de agregar sitios de la restricción.
Los sitios de la restricción son generalmente el punto de ebullición 6 en longitud. Si usted no va al subclone el producto de la polimerización en cadena, usted necesita agregar los nucleótidos 5 ' del sitio de la restricción
Esto permite que la enzima de la restricción ate a y corte el sitio de la restricción para ser más eficiente.
Secuencia de la cartilla del sitio de la restricción del espaciador (diseñada por programa de la cartilla)
punto de ebullición 3 --6bp punto de ebullición del 15-22
Polimerización en cadena Subcloning
(Subclone significa reproducir el producto de la polimerización en cadena en un vector antes de que usted lo inserte en su vector del interés. Las ventajas de esto incluyen el hecho de que usted nunca tiene que polimerización en cadena su separador de millares otra vez, usted lo tendrán siempre en el refrigerador, y usted puede crecer tanto como usted quiere con bacterias.)
De nuestra experiencia, cortar productos de la polimerización en cadena es generalmente mucho menos eficiente que fragmentos del corte fuera de vectores. Así, cortar productos de la polimerización en cadena y la clonación de ellos en su vector directamente pueden no estar que eficiente y usted pueda tener apuro el hacer de esto.
Ésa es manera subcloning en un vector subcloning es generalmente la mejor.
Vectores del TOPO
Los vectores del TOPO son grandes para subcloning, aunque puedan ser costosos. Le salvarán tiempo a largo plazo, y hacen productos de la polimerización en cadena de la reproducción más fáciles y más eficientes.
La razón de esto es que usted puede digerir fácilmente la DNA en un plásmido. Es más eficiente para la enzima de la restricción pues puede atar fácilmente a y digerir su pedazo.
Las desventajas son que usted debe tener condiciones eficientes y optimizadas de la polimerización en cadena. La presencia de muchas vendas en su polimerización en cadena le hará si no imposible difícil reproducir su producto de la polimerización en cadena del interés.
Usted puede generalmente subclone su producto de la polimerización en cadena en approximadamente 2 días. La ligadura tarda solamente 5 minutos y usted puede platear a sus colonias bacterianas el día de la ligadura. Una vez que usted escoge a colonias el next day y las crece en media, usted no sólo amplifica su separador de millares, usted también ahora tiene una colonia bacteriana de su separador de millares subcloned que usted pueda congelar con glicerol en el nitrógeno líquido por años.
¡Esto ayuda realmente cuando usted necesita hacer otra construcción con su separador de millares!