Reproducción de PCR
Productos De la Reproducción PCR
Si usted desea reproducir un fragmento de la DNA en un plasmid o una construcción, una de las maneras más fáciles de hacer esto está utilizando PCR. Si usted tiene el fragmento o gene de la DNA ya en un plasmid, y los sitios de la restricción que flanquean el fragmento son compatibles con el plasmid nuevo que usted desea reproducirlo en, la digestión de la enzima de la restricción trabaja generalmente bien.
Sin embargo, si usted desea dirigir los sitios nuevos de la restricción para el fragmento, las canceladuras de la construcción del fragmento, o los sitios del mutate dentro de la DNA, la reacción en cadena de PCR o de la polimerasa del fragmento de la DNA es una de las maneras más fáciles y mejores de reproducir su fragmento usando PCR.
Diseñar las cartillas para la reproducción de PCR
Las cartillas para la reproducción de PCR son generalmente más largas debido a la necesidad de agregar sitios de la restricción.
Los sitios de la restricción son generalmente el punto de ebullición 6 en longitud. Si usted no va al subclone el producto de PCR, usted necesita agregar los nucleotides 5' del sitio de la restricción
Esto permite que la enzima de la restricción ate a y corte el sitio de la restricción para ser más eficiente.
Secuencia de la cartilla del sitio de la restricción del espaciador (diseñada por programa superelegante)
3 punto de ebullición -- 6bp -- punto de ebullición 15-22
PCR Subcloning
(Subclone significa reproducir el producto de PCR en un vector antes de que usted lo inserte en su vector del interés. Las ventajas de esto incluyen el hecho de que usted nunca tiene que PCR su relleno otra vez, usted lo tendrán siempre en el refrigerador, y usted puede crecer para arriba tanto como usted desea con bacterias.)
De nuestra experiencia, que corta PCR productos es generalmente mucho menos eficiente que fragmentos del corte fuera de vectores. Así, los productos de PCR que cortan y reproducirlos en su vector directamente pueden no estar que eficiente y usted pueda tener apuro el hacer de esto.
Ésa es manera subcloning en un vector subcloning es generalmente la mejor.
Vectores del Topo
Los vectores del TOPO son grandes para subcloning, aunque pueden ser costosos. Le ahorrarán tiempo en el funcionamiento largo, y hacen productos de la reproducción PCR más fáciles y más eficientes.
La razón de esto es que usted puede digerir fácilmente la DNA en un plasmid. Es más eficiente para la enzima de la restricción pues puede atar fácilmente a y digerir su pedazo.
Las desventajas son que usted debe tener condiciones eficientes y optimizadas de PCR. La presencia de muchas vendas en su PCR le hará si no imposible difícil reproducir su producto de PCR del interés.
Usted puede generalmente subclone su producto de PCR en approximadamente 2 días. La ligadura toma solamente 5 minutos y usted puede platear a sus colonias bacterianas el día de la ligadura. Una vez que usted escoja a colonias el día siguiente y las crezca en medios, usted no solamente amplificar su relleno, usted también ahora tiene una colonia bacteriana de su subcloned el relleno que usted puede congelar con glicerol en el nitrógeno líquido por años.
¡Esto realmente ayuda cuando usted necesita hacer otra construcción con su relleno!