ENZIMAS DE LA POLIMERIZACIÓN EN CADENA: Polimerasas de la polimerización en cadena
Polimerasas de la polimerización en cadena - la última guía
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Polimerasas de la polimerización en cadena: Una introducción
La opción de la polimerasa de DNA empleada por la polimerización en cadena es determinada por las metas del experimento. Ahora hay una plétora de enzimas disponibles en el comercio a elegir de ese diferencia en su estabilidad termal, processivity, y fidelidad. La enzima más de uso general y lo más extensivamente posible estudiada es polimerasa de DNA de Taq.
Polimerasas iniciales de la polimerización en cadena
Las polimerasas de DNA usadas originalmente en las primeras reacciones de la polimerización en cadena fueron extraídas de la bacteria Escherichia Coli. Aunque esta enzima fuera una herramienta inestimable para muchas aplicaciones de la investigación de la biología molecular en el pasado e incluso hoy, tenía muchas desventajas en la polimerización en cadena original. En la polimerización en cadena, la reacción de la polimerización en cadena debe ser desnaturalizada calentando el producto double-stranded de la DNA después de cada ciclo. Desafortunadamente, calentando también irreversible hizo inactivo la polimerasa de DNA de Escherichia Coli. Las partes alícuotas frescas de la enzima tuvieron que ser agregadas manualmente al principio de cada ciclo. Con 30-40 ciclos de la polimerización en cadena, esto era una tarea muy laboriosa y aburrida.
Qué fue requerida era una polimerasa de DNA que seguido siendo estable durante el paso de progresión de la desnaturalización de la DNA realizado en 90°C o vibra. Un descubrimiento hizo la solución mucho más fácil. El aquaticus termófilo de la bacteria fue aislado a partir de los resortes calientes del agua. Esta bacteria podía sobrevive y prolifera en extremadamente las temperaturas del apogeo de los resortes calientes. El aislamiento de la polimerasa de DNA de esta bacteria rindió una polimerasa de la polimerización en cadena que no fue hecha inactivo rápidamente en las temperaturas altas. Gelfand y otros en la corporación de Cetus purificó y reprodujo con éxito esta polimerasa ahora llamada de Taq de la polimerasa de la polimerización en cadena (aquaticus termófilo en cortocircuito).
Esto permitió 30-40 ciclos de la amplificación de la polimerización en cadena que se realizará sin la necesidad de abrir el tubo de la reacción de la polimerización en cadena y de agregar la polimerasa fresca. Esta contaminación potencial también reducida que podría ser introducida al agregar la polimerasa manualmente sobre 20-30 mide el tiempo en las reacciones originales de la polimerización en cadena. También, debido a la naturaleza de la bacteria termófila y de la polimerasa, Taq funcionó óptimo en las temperaturas alrededor de 72°C, permitiendo que la síntesis de la DNA sea realizada en mucho más arriba
temperaturas que posible con la enzima de Escherichia Coli. Esto tenía la ventaja de permitir que el hilo de la DNA del modelo sea copiado en una fidelidad mucho más alta debido a un strigency más alto del recocido de la cartilla de la polimerización en cadena. Este otros productos no específicos reducidos que habían afectado a muchas reacciones anteriores de la polimerización en cadena.
Polimerasa de DNA de TAQ
La polimerasa también “Taq simplemente llamado” de Taq, es una polimerasa de DNA termoestable usada en la reacción en cadena de polimerasa (polimerización en cadena) para catalizar la reacción de la réplica de la DNA en el ciclo de la polimerización en cadena. De este modo de la amplificación, la polimerización en cadena puede examinar para la presencia o la ausencia de un gene del interés en una muestra biológica.
Modelo molecular de la polimerasa de DNA de Taq. La estructura cristalina de la DNA-Polimerasa de Taq muestra una nueva orientación para el dominio Estructura-Específico de la nucleasa.
La polimerasa de DNA de Taq substituyó la polimerasa de DNA de Escherichia Coli en la polimerización en cadena, debido a sus características termoestables. Taq primero fue aislado del aquaticus de Thermus, una bacteria que vive en resortes calientes y respiraderos hidrotérmicos.
Taq era la primera polimerasa que podía soportar la desnaturalización condiciona (sobre el °C) 90 requerido durante el ciclo de la polimerización en cadena.
Taq tiene un período nzymatic de e en 95°C de cerca de 40 Min. Para más características de Taq, vea el vector abajo.
Una de las desventajas importantes de las polimerasas de Taq es su fidelidad baja de la réplica. Pues Taq no tiene exonuclease a 3 ' 5 ' el corregir del mecanismo para substituir una discordancía accidental en el hilo nuevamente sintetizado de la DNA, Taq produce más errores que corrigiendo las polimerasas tales como Pfu.
La polimerasa de DNA de Taq también es única en que produce productos de la polimerización en cadena con proyecciones de A (adenina). Esto fue encontrada para ser absolutamente útil, y explotada para producir la reproducción y la reproducción del TOPO (Invitrogen) de TA. Estos métodos emplean un vector de la reproducción (o el plásmido) que posea proyecciones de T (Thymine). Esto permite la ligadura usando el topoisomerase o la ligasa de la DNA que se lograrán rápidamente con las proyecciones de A del producto de la polimerización en cadena
Polimerasa de DNA de PFU
La polimerasa de DNA de Pfu es una enzima encontrada en el furiosus hipertermofílico de Pyrococcus del archaeon, donde funciona in vivo para replegar la DNA del organismo. In vitro, Pfu se utiliza para amplificar rápidamente la DNA en la reacción en cadena de polimerasa, donde la enzima sirve la función central de copiar un nuevo hilo de la DNA durante cada paso de progresión de la extensión.
La superioridad de la polimerasa de Pfu la diferencia principal entre Pfu y las enzimas alternativas es termoestabilidad superior de Pfu y “corregir” las características comparadas a otras polimerasas termoestables. Desemejante de la polimerasa de DNA de Taq, la polimerasa de DNA de Pfu posee el exonuclease a 3 ' 5 ' que corrige la actividad, significando que trabaja su manera a lo largo de la DNA del extremo a los 3 ' final 5 ' y corrige errores del nucleótido-misincorporation. Esto significa que los fragmentos polimerasa-generados DNA de la polimerización en cadena de Pfu tendrán pocos errores que los separadores de millares Taq-generados de la polimerización en cadena. Consecuentemente, Pfu se utiliza más comunmente para la reproducción molecular de los fragmentos de la polimerización en cadena que el Taq históricamente popular. Pfu disponible en el comercio da lugar típicamente a un índice de error de 1 en 1.3 millones de pares bajos y puede rendir 2.6% productos transformados al amplificar los fragmentos 1kb usando la polimerización en cadena. Sin embargo, Pfu es más lento y requiere típicamente 1-2 minutos para amplificar 1kb de la DNA en 72° C. Usando Pfu la polimerasa de DNA en reacciones de la polimerización en cadena también da lugar a productos embotado-terminados de la polimerización en cadena. La polimerasa de DNA de Pfu es por lo tanto superior para las técnicas que requieren síntesis de alta fidelidad de la DNA, pero se puede también utilizar conjuntamente con la polimerasa de Taq para obtener la fidelidad de Pfu con la velocidad de la actividad de la polimerasa de Taq.
Historia
Los científicos se asociaron a la compañía Stratagene de Biotech, basado en La Jolla, California descubrieron la superioridad de Pfu sobre Taq en 1991. Publicaron su trabajo en el gene del diario en diciembre de ese año (gene. 12 de diciembre 1991; 108 (1): 1-6). LOS E.E.U.U. La patente 5.489.523 fue concedida sobre Pfu exonuclease-deficiente en febrero de 1996 mientras que la patente 5.545.552 de los E.E.U.U. sobre Pfu sí mismo fue concedida en agosto de 1996.
Polimerasas de la polimerización en cadena
Resumen de las polimerasas disponibles de la polimerización en cadena y de sus características.
Polimerasa de DNA |
Fuente biológica |
5 '--3 ' Exonuclease Actividad |
3 '--5 ' Exonuclease Actividad |
período 95°C (minuto) |
Nombres comerciales |
Compañías de abastecimiento |
Tarifa de la extensión (nucleosides/s) |
Tarifa de error |
Tiempo (s) a 1kb (72°C) |
Taq |
Thermus Aquaticus |
+ |
- |
40 |
AmpliTaq, oro de AmpliTaq |
Promega, Roche, Invitrogen y muchos otros. |
75 |
1 en 10^3 |
32 |
Pfu |
Furiosus de Pyrococcus |
- |
+ |
120 |
PfuTurbo |
Stratagene, Fermentas, Invitrogen entre otros
|
60 |
1 en 1.3 x 10^6 |
60-120 |
Pwo
|
Woesei de Pyrococcus |
- |
+ |
N/A |
N/A |
N/A |
N/A |
||
Tfl |
Thermas flavus |
- |
- |
||||||
rTth |
Themus termófilo |
+ |
- |
20 |
|||||
Tli |
Litoris de Thermus |
- |
+ |
400 |
Respiradero |
||||
Tma |
Maritima de Thermotoga |
- |
+ |
>50 |
|||||
Polimerización en cadena y polimerasas
La polimerización en cadena se ha realizado en la DNA de 10 kilobases más grandes, no obstante la polimerización en cadena media es solamente varios cientos a unos miles bases de la DNA. El problema con la polimerización en cadena larga es que hay un equilibrio entre la exactitud y el processivity de la enzima. Generalmente, cuanto más largo es el fragmento, mayor es la probabilidad de errores.
Referencias de las polimerasas de la polimerización en cadena
1.
2.
3.
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