Localización de averías de la polimerización en cadena
Problemas y soluciones, ayuda de la polimerización en cadena de la polimerización en cadena
Cuál es su problema de la polimerización en cadena?:
¿Productos no específicos largos de la polimerización en cadena?
¿Formación de dimero de la cartilla?
Problema:
Productos no específicos largos en la polimerización en cadena
Al funcionar con un gel de la agarosa usted mancha vendas no específicas más grandes de la polimerización en cadena que las correctas clasifiquen.
Soluciones a los productos no específicos largos en la polimerización en cadena:
Disminuya el tiempo de recocido
Disminuya el tiempo de la extensión
Disminuya la temperatura de la extensión a 62-68º C
Aumente la concentración del KCl (almacenador intermediario) a 1.2x-2x, pero guarde la concentración del MgCl2 en 1.5-2mM
Aumente la concentración del MgCl2 hasta 3-4.5 milímetros pero guarde el constante de la concentración del dNTP.
Utilice menos cartilla
Tome menos modelo de la DNA
Tome menos polimerasa de Taq
Si ningunos de los trabajos antedichos: controle la cartilla para saber si hay secuencias repetidores (la RÁFAGA alinea la secuencia con las bases de datos) y cambie las cartillas
Combinación de alguno/todo el arriba.
Problema:
Dimeros de la cartilla de la polimerización en cadena
Al funcionar con un gel de la agarosa, usted mancha algunas vendas muy pequeñas de la polimerización en cadena. Éstas son la talla de su cartilla o sobre la talla de ambas sus cartillas (A y B) junto. Éstos se llaman los “dimeros de la cartilla” y son formados por el recocido de su cartilla con sí mismo o con la otra cartilla.
Soluciones a los dimeros de la cartilla en la polimerización en cadena:
Utilice menos cartilla.
La cartilla del reajuste y pide un nuevo tratamiento por lotes. Cerciórese de le software y comprobación para del diseño de la cartilla del uso el uno mismo-recocido y que las cartillas no compartan un porcentaje grande de la secuencia complementaria. Controle las cartillas cuidadosamente para saber si hay homo-dimero y formación del hetero-dimero con OligoAnalyzer
Conduzca la polimerización en cadena con y sin formamida.
Titule la concentración de Mg2+ (MgCl - 1.5, 2.0, 2.5 y 3.0 milímetros).
Aumente la cantidad del modelo de la DNA (concentración).
Aumente la temperatura del recocido (intento que optimiza usando una máquina de la polimerización en cadena del gradiente para encontrar la temperatura óptima para el recocido).
Intente alcanzar DMSO el 5%.
Intente usar la polimerización en cadena de HotStart en vez de la polimerización en cadena regular de la polimerasa de Taq.
Combinación de alguno/todo el arriba.