RT-PCR
Invierta la reacción en cadena de polimerasa de la transcripción
La reacción en cadena reversa de polimerasa de la transcripción (RT-PCR) se basa en la reacción en cadena de polimerasa (polimerización en cadena). Se basa más importantemente en el proceso de la transcripción reversa, que el revés transcribe el ARN en la DNA y fue aislado inicialmente de retroviruses.
Las técnicas de RT-PCR permiten la formación de cDNA (complementario o de DNA de la copia) del ARN, que salva la secuencia de ARN (tal como ARN de mensajero, mRNA) en la forma más estable de ácido nucléico, DNA. Esta transcripción reversa del ARN en su DNA reversa del complemento (cDNA) es el primer paso de progresión de un proceso generalmente de dos etapas de RT-PCR. Además, copiando el ARN en la DNA, una puede entonces amplificar la secuencia del cDNA usando las cartillas específicas para la secuencia de la DNA. Esta amplificación es el segundo paso de progresión principal final del proceso de dos etapas de RT-PCR.
El proceso de RT-PCR
El primer paso de progresión de RT-PCR se refiere como la “primera reacción del hilo”. En la reacción del primero-hilo, el cDNA también llamado complementario de la DNA, se hace del modelo del ARN de mensajero del interés usando despegue oligo (acto polivinílico-dTs similar a las cartillas y al lazo a los 3 ' secuencia situada en los 3 ' UTR - región sin traducir del polyA, que están presentes en la mayoría de los mRNAs), dNTPs del oligonucleótido, y una polimerasa de DNA ARN-dependiente, invierte transcriptase, con el proceso de la transcripción reversa.
Estos factores se combinan en un almacenador intermediario reverso del transcriptase para 1 hora en 37°C. Después de que la reacción reversa del transcriptase sea completa, y se ha sintetizado el cDNA, se agrega RNaseH (una enzima de la digestión del ARN) que digiere el ARN lejos del híbrido del ARN-cDNA. Después de la incubación con RNaseH, la reacción en cadena estándar de la polimerización en cadena o de polimerasa se conduce usando las cartillas oligas de la DNA específicas para la secuencia de interés. Se refiere este segundo paso de progresión como la “segunda reacción del hilo”.
Así agregando la polimerasa de DNA termoestable, las cartillas por aguas arriba y rio abajo de la DNA, la sola DNA trenzada se convierten en doble trenzado y son amplificadas, permitiendo la detección de incluso secuencias raras o bajas del mRNA de la copia amplificando su DNA complementaria.
Aplicaciones de RT-PCR
La amplificación exponencial de la secuencia complementaria de mRNA o las secuencias del ARN vía la reacción en cadena reversa de polimerasa de la transcripción permite una alta técnica de la detección de la sensibilidad, donde el número de copia bajo o las moléculas menos abundantes del ARN puede ser detectado. También se utiliza para reproducir secuencias del mRNA bajo la forma de DNA complementaria, permitiendo que las bibliotecas del cDNA (bibliotecas del cDNA) sean creadas que contienen todas las secuencias del mRNA de genes expresados en una célula. Además, permite la creación de las construcciones del cDNA que fueron reproducidas por RT-PCR y permiten la expresión de genes en los niveles del ARN y de la proteína para el estudio adicional.