RT-PCR
Invierta La Reacción en Cadena De la Polimerasa De la Transcripción
La reacción en cadena reversa de la polimerasa de la transcripción (RT-PCR) se basa en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se basa más importantemente en el proceso de la transcripción reversa, que el revés transcribe el RNA en la DNA y fue aislado inicialmente de retroviruses.
Las técnicas de RT-PCR permiten la formación de la DNA (complementaria o de la DNA de la copia) del RNA, que almacena la secuencia del RNA (tal como RNA, mRNA del mensajero) en la forma más estable de ácido nucleic, DNA. Esta transcripción reversa del RNA en su DNA reversa del complemento (DNA) es el primer paso de un proceso generalmente de dos etapas de RT-PCR. Además, copiando el RNA en la DNA, una puede entonces amplificar la secuencia de la DNA usando las cartillas específicas para la secuencia de la DNA. Esta amplificación es el segundo paso principal final del proceso de dos etapas de RT-PCR.
El proceso de RT-PCR
El primer paso de RT-PCR se refiere como la "primera reacción del filamento". En la reacción del primero-filamento, la DNA también llamada complementaria de la DNA, se hace de la plantilla del RNA del mensajero del interés usando despegue del oligo (acto poly-dTs-dTs similar a las cartillas y al lazo ' secuencia del polyA a los 3 situada en el 3' UTR - región sin traducir, que están presentes en la mayoría de los mRNAs), dNTPs del oligonucleotide, y una polimerasa RNA-dependiente de la DNA, invierte transcriptase, con el proceso de la transcripción reversa.
Estos factores se combinan en un almacenador intermediario reverso del transcriptase para 1 hora en 37°C. Después de que la reacción reversa del transcriptase sea completa, y se ha sintetizado la DNA, se agrega RNaseH (una enzima de la digestión del RNA) que digiere el RNA lejos del híbrido RNA-DNA. Después de la incubación con RNaseH, se conduce la reacción en cadena estándar de PCR o de la polimerasa usando las cartillas del oligo de la DNA específicas para la secuencia del interés. Se refiere este segundo paso como la "segunda reacción del filamento".
Así agregando la polimerasa termoestable de la DNA, las cartillas por aguas arriba y enes sentido descendiente de la DNA, la sola DNA trenzada se convierten en doble trenzado y son amplificadas, permitiendo la detección de las secuencias raras o bajas uniformes del mRNA de la copia amplificando su DNA complementaria.
Usos de RT-PCR
La amplificación exponencial de la secuencia complementaria del mRNA o las secuencias del RNA vía la reacción en cadena reversa de la polimerasa de la transcripción permite una alta técnica de la detección de la sensibilidad, donde el número bajo de la copia o las moléculas menos abundantes del RNA puede ser detectado. También se utiliza para reproducir secuencias del mRNA en la forma de DNA complementaria, permitiendo que las bibliotecas de la DNA (bibliotecas de la DNA) sean creadas que contienen todas las secuencias del mRNA de los genes expresados en una célula. Además, permite la creación de las construcciones de la DNA que fueron reproducidas por RT-PCR y permiten la expresión de genes en los niveles del RNA y de la proteína para el estudio adicional.