PCR In situ
Définition de PCR in situ
PCR in situ (ISH) est une réaction en chaîne de polymérase qui a lieu réellement à l'intérieur de la cellule sur une glissière. L'amplification in situ de PCR peut être exécuté sur le tissu ou les cellules fixe.
Introduction In situ de PCR
Pendant le déclenchement et la progression de la maladie, les quantités minutieuses d'un produit dans de petites populations des cellules ou les tissus peuvent être essentiels pour la pathogénie de la maladie.
Dans beaucoup de maladies d'lent-évolution qui ont besoin de des mois ou même des années pour se manifester médicalement, on lui a montré que la majorité de la population affectée de cellules est dans un état transcriptionally inactif, et à un niveau d'un gène par cellule hôte.
Les méthodes d'hybridation d'acide nucléique et la réaction en chaîne de polymérase (PCR) tous les deux ont été utilisées pour examiner l'expression et la détection de tels gènes affectés pendant la pathogénie. Tandis que ces deux techniques sont tout à fait utiles, l'inconvénient de ces techniques est qu'elles entreprennent essentiellement des études d'expression et de population de cellules. Des acides nucléiques sont isolés dans une population des cellules qui contient un nombre suffisant de molécules pour détecter directement par des techniques standard d'hybridation, ou, quand une sous-population contient aussi peu comme copie simple d'acide nucléique, cette molécule amplifiée par le PCR, et détectée après amplification.
L'hybridation in situ (ISH) s'applique la méthodologie de la technique d'hybridation d'acide nucléique au niveau cellulaire. PCR in situ cytochemistry et immunocytochemistry de combinaison, permet à l'identification des marqueurs cellulaires d'être identifiée, et permet plus loin la localisation de à des ordres spécifiques de cellules dans des populations de cellules, telles que des tissus et des échantillons de sang.
PCR in situ est limité à la détection du matériel non-genomic tel que l'ARN, les gènes ou les génomes, car la limite de détection en la plupart des conditions est plusieurs copies de l'acide nucléique de cible par cellule. Par conséquent, en raison des limitations de nombre de copie, hybridation de l'ARN est plus sensible que la détection d'ADN.
Les facteurs affectant la sensibilité in situ de PCR incluent :
1) le strandedness de la molécule de cible
2) le manque d'un ordre complémentaire proximal aux ordres de cible
Renversez la transcription in situ transcriptase-catalysée a été même employé pour détecter RNAs qui se produisent au nombre relativement élevé de copie.
PCR In situ (ISH) Protcol
Au commencement la stoechiométrie des composants d'acide nucléique fait la réaction amorce-conduite. Pendant que la réaction procède cependant, le produit de PCR lui-même commence à fonctionner comme cible pour davantage d'amplification, aussi bien qu'une amorce pour davantage d'élongation. C'est l'accumulation des ordres prolongés dans des réactions multiples qui est maintenue par la cellule fixe et agit en tant que cible pour la sonde radioactive dans la phase de détection.
La nature physique complexe dans une cellule fixe empêche l'efficacité de la polymérase aussi bien que la diffusion et le recuit, et les temps d'élongation sont ainsi beaucoup plus longs que ceux conduits dans (PCR standard) les états aqueux. Le signal optimum est producted habituellement en utilisant une élongation 15 minute.