ACP in situ
Définition d'ACP in situ
L'ACP in situ (ISH) est une amplification en chaîne par réaction qui a lieu réellement à l'intérieur de la cellule sur une glissière. L'amplification in situ d'ACP peut être exécutée sur le tissu ou les cellules fixe.
Introduction in situ d'ACP
Pendant le déclenchement et la progression de la maladie, les quantités minutieuses d'un produit dans de petites populations des cellules ou les tissus peuvent être essentiels pour la pathogénie de la maladie.
Dans beaucoup de maladies lent-en évolution qui ont besoin de des mois ou même des années pour se manifester médicalement, on lui a affiché que la majorité de la population affectée de cellules est dans un état transcriptionally inactif, et à un niveau d'un gène par cellule hôte.
Les méthodes d'hybridation d'acide nucléique et l'amplification en chaîne par réaction (ACP) tous les deux ont été utilisées pour examiner l'expression et la détection de tels gènes affectés pendant la pathogénie. Tandis que ces deux techniques sont tout à fait utiles, l'inconvénient de ces techniques est qu'elles entreprennent essentiellement des études d'expression et de population de cellules. Des acides nucléiques sont isolés dans une population des cellules qui contient un nombre suffisant de molécules pour détecter directement par des techniques standard d'hybridation, ou, quand une sous-population contient aussi peu comme copie simple d'acide nucléique, cette molécule amplifiée par l'ACP, et détectée après amplification.
L'hybridation in situ (ISH) s'applique la méthodologie de la technique d'hybridation d'acide nucléique au niveau cellulaire. La combinaison de la cytochimie et de l'ACP immunocytochemistry et in situ permet à l'identification des repères cellulaires d'être identifiée, et permet plus loin la localisation de à des ordres spécifiques de cellules dans des populations de cellules, telles que des tissus et des prises de sang.
L'ACP in situ est limité à la détection du matériel non-genomic tel que l'ARN, les gènes ou les génomes, car la limite de détection en la plupart des conditions est plusieurs copies de l'acide nucléique de cible par cellule. Par conséquent, en raison des limitations de nombre de copie, hybridation de l'ARN est plus sensible que la détection d'ADN.
Les facteurs affectant la sensibilité in situ d'ACP incluent :
1) le strandedness de la molécule de cible
2) le manque d'un ordre complémentaire proximal aux ordres de cible
Renversez la transcription in situ transcriptase-catalysée a été même utilisé pour détecter RNAs qui se produisent au nombre de copie relativement élevé.
ACP in situ (ISH) Protcol
Au commencement la stoechiométrie des composants d'acide nucléique fait la réaction amorce-pilotée. Pendant que la réaction procède cependant, le produit d'ACP lui-même commence à fonctionner comme cible pour davantage d'amplification, aussi bien qu'une amorce pour davantage d'élongation. C'est l'accumulation des ordres allongés dans des réactions multiples qui est maintenue par la cellule fixe et agit en tant que cible pour la sonde radioactive dans la phase de détection.
La nature physique complexe dans une cellule fixe empêche l'efficacité de la polymérase aussi bien que la diffusion et le recuit, et les temps d'élongation sont ainsi beaucoup plus longs que ceux conduits dans (ACP standard) les états aqueux. Le signal optimum producted habituellement utilisant une élongation 15 minute.