PCR Inverse
Fond Inverse de PCR
PCR inverse a également appelé IPCR, et a été décrit la première fois par Ochman et autres en 1988 (1).
Une limitation de PCR standard est que les régions 5'et
3'de flanquement de votre fragment d'ADN d'intérêt doivent être
connues. PCR inverse vous permet de conduire PCR quand vous avez
seulement l'information d'un ordre interne.
La réaction en chaîne de polymérase inverse est une variante de PCR, et est employée quand seulement un ordre interne de l'ADN de cible est connu. Il est donc très utile en identifiant des ordres de flanquement d'ADN des insertions genomic. Semblable à d'autres méthodes de PCR, PCR inverse amplifie l'ADN de cible en utilisant la polymérase d'ADN.
PCR inverse emploie PCR standard (réaction en chaîne
de polymérase), toutefois il fait orienter les amorces dans la
direction d'inversion de l'orientation habituelle. Le calibre
pour les amorces renversées est un fragment de restriction qui a
été ligaturé sur lui-même pour former un cercle.
La Méthode Inverse de PCR
La méthode inverse de PCR inclut une série de digestions et de art de l'auto-portrait-ligations avec de l'ADN coupé par une ribonucléase de restriction. Cette coupe a comme conséquence un ordre connu à l'une ou l'autre fin des ordres inconnus.
Étapes Inverses de PCR
1) l'ADN de cible est légèrement coupée en plus
petits fragments de plusieurs kilobases par digestion de ribonucléase
de restriction.
2) art de l'auto-portrait-ligation est induit sous de basses concentrations
faisant reformer l'épine dorsale de phosphate. Ceci donne un
produit circulaire de ligature d'ADN.
3) l'ADN de cible est alors restriction digérée avec de la
ribonucléase connue. Ceci produit d'une coupe dans l'ordre
interne connu produisant d'un produit linéaire avec des ordres
terminaux connus. Ceci peut maintenant être employé pour PCR
(réaction en chaîne de polymérase).
4) PCR standard est conduit avec des amorces complémentaires
aux ordres internes maintenant connus.
En résumé :
PCR inverse fonctionne pour copier des ordres flanquant un ordre connu. Des ordres de flanquement d'ADN sont digérés et puis ligaturés pour produire de l'ADN circulaire.
Des amorces de PCR se dirigeant loin des ordres connus
sont alors utilisées pour amplifier les ordres de flanquement.
Applications de PCR inverse
PCR inverse a de nombreuses applications dans la biologie moléculaire comprenant l'amplification et l'identification des ordres flanquant les éléments transposable, et l'identification des insertions genomic.
Protocole Inverse de PCR
Références Inverses de PCR
1. Ochman H, Gerber COMME, Hartl DL. La génétique. 1988 Nov;120(3):621-3.