ACP inverse
Fond inverse d'ACP
L'ACP inverse a également appelé IPCR, et a été la première fois décrit par Ochman et autres en 1988 (1).
Une limitation d'ACP standard est que 5 ' et 3 ' régions de flanquement de votre fragment d'ADN d'intérêt doivent être connues. L'ACP inverse te permet de conduire l'ACP quand vous avez seulement l'information d'un ordre interne.
L'amplification en chaîne par réaction inverse est une variante d'ACP, et est utilisée quand seulement un ordre interne de l'ADN de cible est connu. Il est donc très utile en identifiant des ordres de flanquement d'ADN des insertions genomic. Semblable à d'autres méthodes d'ACP, l'ACP inverse amplifie l'ADN de cible utilisant l'ADN polymérase.
L'ACP inverse utilise l'ACP standard (amplification en chaîne par réaction), toutefois il fait orienter les amorces dans la direction d'inversion de l'orientation habituelle. Le descripteur pour les amorces renversées est un fragment de restriction qui a été ligaturé sur lui-même pour former un cercle.
La méthode inverse d'ACP
La méthode inverse d'ACP inclut une série de digestions et d'individu-ligatures avec de l'ADN coupé par une ribonucléase de restriction. Cette coupe a comme conséquence un ordre connu à l'une ou l'autre fin des ordres inconnus.
Étapes inverses d'ACP
1) l'ADN de cible est légèrement coupée en plus petits fragments de plusieurs kilobases par digestion de ribonucléase de restriction.
2) l'Individu-ligature est induite sous de basses concentrations faisant reformer le circuit principal de phosphate. Ceci donne un produit circulaire de ligature d'ADN.
3) l'ADN de cible est alors restriction assimilée avec de la ribonucléase connue. Ceci produit d'une coupe dans l'ordre interne connu produisant d'un produit linéaire avec des ordres terminaux connus. Ceci peut maintenant être utilisé pour l'ACP (amplification en chaîne par réaction).
4) l'ACP standard est conduit avec des amorces complémentaires aux ordres internes connus par maintenant.
En résumé :
L'ACP inverse fonctionne pour copier des ordres flanquant un ordre connu. Des ordres de flanquement d'ADN sont assimilés et puis ligaturés pour produire de l'ADN circulaire.
Des amorces d'ACP se dirigeant à partir des ordres connus sont alors utilisées pour amplifier les ordres de flanquement.
Applications d'ACP inverse
L'ACP inverse a de nombreuses applications dans la biologie moléculaire comprenant l'amplification et l'identification des ordres flanquant les éléments transposables, et l'identification des insertions genomic.
Protocole inverse d'ACP
Références inverses d'ACP
1. Ochman H, Gerber COMME, Hartl DL. La génétique. 1988 nov. ; 120 (3) : 621-3.