Nettoyage de PCR
Fond De Nettoyage de PCR
Généralement, plus que vous optimisez au commencement votre PCR, moins seront votre besoin de méthodes rigoureuses de nettoyage de post-PCR.
Si vos états de PCR sont bien optimisés, la majeure partie de vos amorces supplémentaires et de volonté des dNTP soit employée vers le haut pendant les amplifications de pcr, ainsi il y aura seulement très peu de facteurs d'intervention et il peut être possible d'effectuer l'ordonnancement direct. Si vous allez secondaire-copiez votre fragment de PCR dans un vecteur de clonage de TOPO, alors vous devez avoir seulement une bande principale de PCR évidente sur votre gel. Si vous avez les bandes multiples, vous assurez vous optimiser vos états de PCR d'abord.
Voir également le produit de PCR ordonnancer et optimiser PCR.
Des produits de PCR n'ont pas besoin d'être épurés avant d'ordonnancer cependant pour obtenir des données d'ordonnancement précises, il est habituellement recommandés de nettoyer vos produits de PCR après amplification.
Si vous avez ajouté des montants excessifs d'amorce ou les amorces sont inutilisées, ces amorces peuvent agir en tant qu'amorces de prolongation pendant l'ordonnancement, ayant pour résultat la génération d'un ensemble additionnel de fragments d'ordonnancement teindre-marqués qui peuvent rendre ordonnançant l'interprétation de données difficile si non impossible.
des prducts du Poteau-nettoyage PCR devraient être courus sur un gel d'agarose pour examiner la qualité de la purification. Si le barbouillage ou les bandes multiples sont présentes, souillure de produits, vous pas habituellement des données d'ordre de haute qualité d'obatin.
La purification de gel du fragment peut être accomplie en utilisant une basse agarose de la fondre-température. Vous pouvez enlever votre bande sous la lumière UV avec un rasoir, et extrayez l'ADN à partir de la tranche en utilisant des méthodes d'extraction d'electroelution ou de gel en utilisant des amortisseurs/colonnes.
Nettoyage de PCR pour ordonnancer et copier
Pour enlever les dNTPs excessifs, les amorces non enregistrées, et les produits non spécifiques de PCR vous pouvez employer plusieurs méthodes.
Kit de purification de Qiagen PCR et d'autres kits de nettoyage de PCR.
Vous pouvez également enlever des amorces et les dNTPs en s'épuisant les produits de PCR sur une agarose gélifient, en coupant les bandes et en conduisant l'extraction d'ADN à partir du gel d'agarose en utilisant le kit de purification de gel de Qiagen.
Après Nettoyage de PCR
Après n'importe quelle méthode de nettoyage de PCR, vous devriez établir la qualité et la quantité du produit de PCR. Vous pouvez faire ceci en courant les échantillons en utilisant des electrophoreiss de gel d'agarose avec un marqueur de concentration en ADN.
Vous pouvez également estimer la quantité d'ADN en utilisant un spectrophotomètre UV.