Clonage d'ACP
Produits d'ACP de clonage
Si vous voulez copier un fragment de l'ADN dans un plasmide ou un élément, une des voies les plus faciles de faire ceci utilise l'ACP. Si vous avez le fragment ou le gène d'ADN déjà dans un plasmide, et les sites de restriction flanquant le fragment sont compatibles avec le nouveau plasmide que vous voulez le copier dans, la digestion d'enzymes de restriction fonctionne bien habituellement.
Cependant, si vous voulez machiner de nouveaux sites de restriction pour le fragment, construire des suppressions avec du fragment, ou subir une mutation des sites dans l'ADN, l'ACP ou l'amplification en chaîne par réaction du fragment d'ADN est l'une des voies les plus faciles et meilleures de copier votre fragment utilisant l'ACP.
Concevoir des amorces pour le clonage d'ACP
Les amorces pour le clonage d'ACP sont habituellement plus longues en raison de la nécessité d'ajouter des sites de restriction.
Les sites de restriction sont habituellement le point d'ébullition 6 de longueur. Si vous n'allez pas au subclone le produit d'ACP, vous devez ajouter les nucléotides 5 ' du site de restriction
Ceci permet à l'enzyme de restriction de lier à et de couper le site de restriction pour être plus efficace.
Ordre d'amorce de site de restriction d'entretoise (conçu par programme d'amorce)
point d'ébullition 3 --6bp point d'ébullition du 15-22
ACP Subcloning
(Subclone signifie pour copier le produit d'ACP dans un vecteur avant que vous l'insériez dans votre vecteur d'intérêt. Les avantages de ceci inclut le fait que vous ne devez de nouveau jamais ACP votre insertion, vous l'auront toujours dans le réfrigérateur, et vous pouvez grandir autant que vous voulez en utilisant des bactéries.)
De notre expérience, la coupure des produits d'ACP est habituellement beaucoup moins efficace que des fragments de découpage hors des vecteurs. Ainsi, la coupure des produits d'ACP et le clonage de eux dans votre vecteur directement peuvent ne pas être qu'efficace et vous pouvez avoir l'ennui faire ceci.
C'est voie subcloning dans un vecteur subcloning est habituellement la meilleure.
Vecteurs de TOPO
Les vecteurs de TOPO sont grands pour subcloning, bien qu'ils puissent être chers. Ils vous sauvegarderont temps à la longue, et rendent des produits d'ACP de clonage plus faciles et plus efficaces.
La raison de ceci est que vous pouvez facilement assimiler l'ADN dans un plasmide. Elle est plus efficace pour l'enzyme de restriction car elle peut facilement lier à et assimiler votre partie.
Les inconvénients sont que vous devez avoir des états efficaces et optimalisés d'ACP. La présence de beaucoup de bandes dans votre ACP lui fera sinon impossible difficile de copier votre produit d'ACP d'intérêt.
Vous pouvez habituellement subclone votre produit d'ACP dans environ 2 jours. La ligature prend seulement 5 minutes et vous pouvez plaquer vos colonies bactériennes le jour de la ligature. Une fois que vous sélectionnez des colonies le next day et les élevez dans les medias, vous amplifiez non seulement votre insertion, vous avez également maintenant une colonie bactérienne de votre insertion subcloned que vous pouvez geler avec du glycérol dans l'azote liquide pendant des années.
Ceci aide vraiment quand vous devez faire un autre élément avec votre insertion !