ENZYMES D'ACP : Polymérases d'ACP

Polymérases d'ACP - le guide final

STATION 2006 d'ACP de copyright

Polymérases d'ACP : Une introduction

Le choix de l'ADN polymérase Utilisé par ACP est déterminé par les buts de l'expérience. Il y a maintenant une pléthore d'enzymes disponibles dans le commerce à choisir du ce diffèrent dans leur stabilité thermique, processivity, et fidélité. L'enzyme la plus utilisée généralement et le plus intensivement la plus étudiée est ADN polymérase de Taq.

Polymérases initiales d'ACP

Les ADN polymérases Utilisés initialement dans les premières réactions d'ACP ont été extraits à partir de la bactérie Escherichia coli. Bien que cette enzyme ait été un outil de valeur inestimable pour beaucoup d'usages de recherches de biologie moléculaire dans le passé et même aujourd'hui, elle a eu beaucoup d'inconvénients dans l'ACP initial. Dans l'ACP, la réaction d'ACP doit être dénaturée en chauffant le produit bicaténaire d'ADN après chaque cycle. Malheureusement, chauffant également a irréversiblement inactivé l'ADN polymérase d'Escherichia coli. Des parties aliquotes fraîches de l'enzyme ont dû être ajoutées manuellement au début de chaque cycle. Avec 30-40 cycles d'ACP, c'était une tâche très laborieuse et de sondage.

Ce qui a été exigé était un ADN polymérase Que resté stable pendant l'étape de dénaturation d'ADN exécutée à 90°C ou hotter. Une découverte a facilité la solution beaucoup. L'aquaticus thermophile de bactérie a été isolé dans les sources thermales de l'eau. Cette bactérie pouvait en mesure survivent et prolifèrent à l'extrème les températures d'hautes eaux des sources thermales. L'isolement de l'ADN polymérase de cette bactérie a rapporté une polymérase d'ACP qui n'a pas été rapidement inactivée à températures élevées. Gelfand et autres à la société de Cetus a avec succès purifié et a copié cette polymérase maintenant appelée de Taq de polymérase d'ACP (aquaticus thermophile en bref).

Ceci a laissé 30-40 cycles de l'amplification d'ACP à exécuter sans nécessité d'ouvrir le tube de réaction d'ACP et d'ajouter la polymérase fraîche. Cette contamination potentielle également réduite qui pourrait être introduite en ajoutant la polymérase manuellement plus de 20-30 chronomètre dans les réactions initiales d'ACP. En outre, en raison de la nature de la bactérie thermophile et de la polymérase, Taq a fonctionné de façon optimale aux températures autour de 72°C, permettant à la synthèse d'ADN d'être exécuté beaucoup à plus haut
les températures que n'était possible avec de l'enzyme d'Escherichia coli. Ceci a eu l'avantage de permettre au brin d'ADN de descripteur d'être copié à une fidélité beaucoup plus élevée due à un plus haut strigency du recuit d'amorce d'ACP. Ce produits non spécifiques réduits encore qui avaient affecté beaucoup de réactions plus tôt d'ACP.

ADN polymérase de TAQ

La polymérase « Taq » simplement nommé également de Taq, est un ADN polymérase Thermostable employé dans l'amplification en chaîne par réaction (ACP) pour catalyser la réaction de réplique d'ADN dans le cycle d'ACP. De cette manière de l'amplification, l'ACP peut examiner pour la présence ou l'absence d'un gène d'intérêt pour un échantillon biologique.

ADN polymérase de Taq

Modèle moléculaire d'ADN polymérase de Taq. La structure cristalline de l'ADN-Polymérase de Taq affiche une nouvelle orientation pour le domaine Structure-Spécifique de nucléase.

L'ADN polymérase de Taq a substitué l'ADN polymérase D'Escherichia coli dans l'ACP, dû à ses propriétés thermostables. Taq a été isolé la première fois dans l'aquaticus de Thermus, une bactérie qui vit dans les sources thermales et les évents hydrothermiques.

Taq était la première polymérase qui pouvait résister à la dénaturisation conditionne (plus de °C) 90 requis pendant le recyclage d'ACP.

Taq a une demi vie nzymatic d'e à 95°C d'environ 40 mn. Pour plus de propriétés de Taq, voyez la table ci-dessous.

Un des inconvénients importants des polymérases de Taq est sa basse fidélité de réplique. Car Taq n'a pas l'exonuclease à 3 ' 5 ' corriger sur épreuves le mécanisme pour substituer une erreur d'assortiment accidentelle dans le brin nouvellement synthétisé d'ADN, Taq produit plus d'erreurs que corrigeant sur épreuves des polymérases telles que Pfu.

L'ADN polymérase de Taq est également seul parce qu'il fabrique des produits d'ACP avec des surplombs d'A (adénine). Ceci s'est avéré tout à fait utile, et a été exploité pour produire le clonage de TA et le clonage de TOPO (Invitrogen). Ces méthodes utilisent un vecteur de clonage (ou le plasmide) qui possède des surplombs de T (Thymine). Ceci permet la ligature utilisant le topoisomerase ou la ligase d'ADN à accomplir rapidement avec les surplombs d'A du produit d'ACP

ADN polymérase de PFU

L'ADN polymérase de Pfu est une enzyme trouvée dans le furiosus hyperthermophile de Pyrococcus d'archaeon, où il fonctionne in vivo pour reproduire l'ADN de l'organization. In vitro, Pfu est employé pour amplifier rapidement l'ADN dans l'amplification en chaîne par réaction, où l'enzyme remplit la fonction centrale de copier un nouveau brin de l'ADN pendant chaque étape d'extension.

La supériorité de la polymérase de Pfu la différence principale entre Pfu et enzymes alternatives est la thermostabilité supérieure de Pfu et « correction sur épreuves » des propriétés comparées à d'autres polymérases thermostables. À la différence de l'ADN polymérase de Taq, l'ADN polymérase de Pfu possède l'exonuclease à 3 ' 5 ' corrigeant sur épreuves l'activité, signifiant que cela fonctionne sa voie le long de l'ADN de l'extrémité aux 3 ' fin 5 ' et corrige des erreurs de nucléotide-misincorporation. Ceci signifie que les fragments d'ACP polymérase-produits par ADN de Pfu auront moins d'erreurs que les insertions Taq-produites d'ACP. En conséquence, Pfu est généralement utilisé pour le clonage moléculaire des fragments d'ACP que le Taq historiquement populaire. Pfu disponible dans le commerce a typiquement comme conséquence une cadence d'erreur de 1 dans 1.3 million de paires de base et peut rapporter 2.6% produits mutés en amplifiant les fragments 1kb utilisant l'ACP. Cependant, Pfu est plus lent et a besoin de typiquement 1-2 minutes pour amplifier 1kb de l'ADN à 72° C. Utilisant Pfu l'ADN polymérase Dans des réactions d'ACP a également comme conséquence les produits émoussé-terminés d'ACP. L'ADN polymérase de Pfu est par conséquent supérieur pour les techniques qui exigent la synthèse de haute fidélité d'ADN, mais peut également être utilisé en même temps que la polymérase de Taq pour obtenir la fidélité de Pfu avec la vitesse de l'activité de polymérase de Taq.

Histoire

Les scientifiques se sont associés à la compagnie biotechnologique Stratagene, basé à La Jolla, la Californie ont découvert la supériorité de Pfu au-dessus de Taq en 1991. Ils ont édité leur travail dans le gène de journal en décembre de cette année (gène. 12 décembre 1991 ; 108 (1) : 1-6). LES États-Unis On a accordé le brevet 5.489.523 au-dessus de Pfu exonuclease-déficient en février 1996 tandis qu'on accordait en août 1996 le brevet 5.545.552 des États-Unis au-dessus de Pfu lui-même.

Polymérases d'ACP

Résumé des polymérases disponibles d'ACP et de leurs propriétés.

ADN polymérase	Source biologique	5 '--3 ' Exonuclease Activité	3 '--5 ' Exonuclease Activité	demi vie 95°C (minute)	Noms commerciaux	Compagnies fournisseuses	Cadence d'extension (nucleosides/s)	Cadence d'erreur	Temps (s) à 1kb (72°C)
Taq	Thermus Aquaticus	+	-	40	AmpliTaq, or d'AmpliTaq	Promega, Roche, Invitrogen et beaucoup d'autres.	75	1 dans 10^3	32
Pfu	Furiosus de Pyrococcus	-	+	120	PfuTurbo	Stratagene, Fermentas, Invitrogen notamment	60	1 dans 1.3 x 10^6	60-120
Pwo	Woesei de Pyrococcus	-	+	NON-DÉTERMINÉ			NON-DÉTERMINÉ	NON-DÉTERMINÉ	NON-DÉTERMINÉ
Tfl	Thermas flavus	-	-
rTth	Themus thermophile	+	-	20
Tli	Litoris de Thermus	-	+	400	Évent
Tma	Maritima de Thermotoga	-	+	>50

ACP et polymérases

L'ACP a été effectué sur l'ADN de plus grandes que 10 kilobases, toutefois l'ACP moyen est seulement plusieurs centaines à quelques mille bases de l'ADN. Le problème avec le long ACP est qu'il y a un équilibre entre l'exactitude et le processivity de l'enzyme. Habituellement, plus le fragment est long, plus la probabilité des erreurs est grande.

Types d'ACP

Ressources d'ACP