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PCR ENZYMES: PCR Polymerases Enzymes PCR: PCR polymérases

PCR Polymerases - The Ultimate Guide PCR polymérases - The Ultimate Guide

copyright 2006 PCR STATION Copyright 2006 PCR STATION

PCR Polymerases: An Introduction PCR polymérases: une introduction

The choice of the DNA polymerase employed by PCR is determined by the goals of the experiment. Le choix de l'ADN polymérase employés par PCR est déterminé par les objectifs de l'expérience. There are now a plethora of commercially available enzymes to choose from that differ in their thermal stability, processivity, and fidelity. Il ya maintenant une pléthore d'enzymes disponibles dans le commerce de choisir de qui diffèrent dans leur stabilité thermique, processivity, et la fidélité. The most commonly used and most extensively studied enzyme is Taq DNA polymerase. Les plus couramment utilisés et les plus étudiés est l'enzyme Taq ADN polymérase.

Initial PCR Polymerases PCR initiale polymérases

The DNA polymerases used originally in the first PCR reactions were extracted from the bacterium Escherichia coli . Les ADN polymérases utilisé initialement dans les premières réactions PCR ont été extraites de la bactérie Escherichia coli. Although this enzyme was an invaluable tool for many molecular biology research uses in the past and even today, it had many disadvantages in the original PCR. Bien que cette enzyme a été un outil précieux pour de nombreux de recherche en biologie moléculaire utilisée dans le passé et aujourd'hui encore, il a de nombreux inconvénients dans la première PCR. In PCR, the pcr reaction must be denatured by heating the double-stranded DNA product after each cycle. Unfortunately, heating also irreversibly inactivated the E. coli DNA polymerase. En PCR, la réaction PCR doit être dénaturé par chauffage de l'ADN double-brin produit après chaque cycle. Malheureusement, le chauffage également inactivé de façon irréversible le E. coli ADN polymérase. Fresh aliquots of enzyme had to be added manually at the start of each cycle. Fresh aliquotes d'enzyme ayant dû être ajoutés manuellement au début de chaque cycle. With 30-40 cycles of PCR, this was a very laborious and boring task. Avec 30-40 cycles de PCR, ce fut une très laborieuse et ennuyeuse tâche.

What was required was a DNA polymerase that remained stable during the DNA denaturation step performed at 90°C or hotter. Ce qui était nécessaire était une ADN polymérase qui est resté stable au cours de l'étape de dénaturation d'ADN effectué à 90 ° C ou plus chaud. A discovery made the solution much easier. Une découverte a fait la solution beaucoup plus facile. The bacterium Thermophilus aquaticus was isolated from water hot springs. Le thermophilus aquaticus bactérie a été isolée à partir de l'eau des sources chaudes. This bacterium was able survive and proliferate in the extremely high water temperatures of the hot springs. Cette bactérie a pu survivre et proliférer dans la très haute température de l'eau des sources thermales. Isolation of the DNA polymerase from this bacterium yielded a PCR polymerase that was not rapidly inactivated at high temperatures. Isolement de l'ADN polymérase de cette bactérie a donné un PCR polymérase qui n'a pas été rapidement inactivé à des températures élevées. Gelfand et al. Gelfand et al. at Cetus corporation successfully purified and cloned this PCR polymerase now called Taq ( T hermophilus aq uaticus in short) Polymerase. à Cetus Corporation avec succès purifié et cloné cette PCR appelle maintenant la polymérase Taq (T hermophilus aq uaticus en bref) de polymérisation.

This allowed a 30-40 cycles of PCR amplification to be performed without the need to open the PCR reaction tube and add fresh polymerase. Ce permis de 30-40 cycles de PCR amplification à être effectué sans la nécessité d'ouvrir le tube de réaction PCR et ajouter de nouvelles polymérase. This also reduced potential contamination that could be introduced when adding polymerase manually over 20-30 times in the original PCR reactions. Cela réduit également les risques de contamination qui pourraient être introduites lors de l'ajout de la polymérase manuellement plus de 20-30 fois dans l'original réactions PCR. Also, due to the nature of the thermophilic bacterium and the polymerase, Taq functioned optimally at temperatures around 72°C, allowing DNA synthesis to be performed at much higher En outre, en raison de la nature de la bactérie thermophile et de la polymérase Taq fonctionné optimale à des températures autour de 72 ° C, permettant la synthèse de l'ADN sera effectué à beaucoup plus élevé
temperatures than was possible with the E. coli enzyme. que la température a été possible grâce à l'enzyme de la bactérie E. coli. This had the advantage of allowing the template DNA strand to be copied at a much higher fidelity due to higher strigency of PCR primer annealing. Cela avait l'avantage de permettre le modèle ADN d'être copié à une fidélité beaucoup plus élevé en raison de la hausse de PCR strigency premier recuit. This further reduced non-specific products which had affected many earlier PCR reactions. Cela réduit non des produits spécifiques qui ont touché de nombreuses réactions PCR plus tôt.

TAQ DNA Polymerase ADN polymérase Taq

Taq Polymerase also simply termed "Taq", is a thermostable DNA polymerase used in polymerase chain reaction (PCR) to catalyze the DNA replication reaction in the PCR cycle. Taq polymérase aussi simplement appelé "Taq", est une ADN polymérase thermostable utilisé dans la réaction en chaîne par polymérase (PCR) à catalyser la réaction de la réplication de l'ADN dans le cycle de PCR. In this manner of amplification, PCR is able to examine for the presence or absence of a gene of interest in a biological sample. De cette manière, de l'amplification, la PCR est en mesure d'examiner pour la présence ou l'absence d'un gène d'intérêt dans un échantillon biologique.

Molecular model of Taq DNA Polymerase. Modèle moléculaire de l'ADN polymérase Taq. Crystal structure of Taq DNA-Polymerase Shows A New Orientation For The Structure-Specific Nuclease Domain. Crystal structure de Taq polymérase ADN-montre une nouvelle orientation de la structure spécifique à la nucléase domaine.

Taq DNA polymerase replaced E.Coli DNA Polymerase in PCR, due to its thermostable properties. ADN polymérase Taq remplacé E. Coli dans l'ADN polymérase PCR, en raison de ses propriétés thermostables. Taq was first isolated from Thermus aquaticus , a bacterium that lives in hot springs and hydrothermal vents. Taq a été isolé pour la première fois de Thermus aquaticus, une bactérie qui vit dans des sources chaudes et les évents hydrothermaux.

Taq was the first polymerase that was able to withstand the denaturing conditions (over 90 °C) required during PCR cycling. Taq a été la première que la polymérase a été en mesure de supporter les conditions de dénaturation (plus de 90 ° C) nécessaires au cours de la PCR en vélo.

Taq has an e nzymatic halflife at 95°C of about 40 min. Taq a un e nzymatic Halflife à 95 ° C environ 40 min. For more properties of Taq, see the table below. Pour plus de propriétés de Taq, voir le tableau ci-dessous.

One of Taq polymerases' major disadvantages is its low replication fidelity. L'un des polymérases Taq "inconvénients majeurs est sa faible fidélité de réplication. As Taq does not have 3' to 5' exonuclease proofreading mechanism to replace an accidental mismatch in the newly synthesized DNA strand, Taq produces more errors than proofreading polymerases such as Pfu. Comme Taq ne dispose pas de 3 'à 5' exonucléase mécanisme de correction d'épreuves pour remplacer un décalage accidentel dans l'ADN nouvellement synthétisé volet, Taq produit plus d'erreurs que la correction d'épreuves telles que les polymérases PFU.

Taq DNA polymerase also is unique in that it produces PCR products with A (Adenine) overhangs. ADN polymérase Taq est aussi unique en ce qu'il produit des produits de PCR avec A (Adenine) surplombe. This was found to be quite useful, and was exploited to produce TA Cloning and TOPO cloning (Invitrogen). Cela s'est avéré être très utile, et a été exploitée pour produire TA clonage et le clonage TOPO (Invitrogen). These methods employ a cloning vector (or plasmid) which possesses T (Thymine) overhangs. Ces méthodes utilisent un vecteur de clonage (ou plasmide) qui possède T (thymine) surplombe. This allows ligation using topoisomerase or DNA ligase to quickly be accomplished with the A overhangs of the PCR product Cela permet à l'aide de la ligature ou de l'ADN topoisomérase ligase rapidement être accompli avec la Une de surplombe le produit de la PCR

PFU DNA Polymerase PFU l'ADN polymérase

Pfu DNA polymerase is an enzyme found in the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus, where it functions in vivo to replicate the organism's DNA. PFU l'ADN polymérase est une enzyme présente dans la hyperthermophiles archaeon Pyrococcus furiosus, où il fonctionne in vivo de reproduire l'ADN de l'organisme. In vitro, Pfu is used to quickly amplify DNA in the Polymerase Chain Reaction, where the enzyme serves the central function of copying a new strand of DNA during each extension step. In vitro, la PFU est utilisé pour amplifier l'ADN dans le Polymerase Chain Reaction, où l'enzyme sert la fonction centrale de la copie d'un nouveau brin d'ADN au cours de chaque étape d'extension.

Superiority of Pfu polymerase The main difference between Pfu and alternative enzymes is Pfu's superior thermostability and 'proofreading' properties compared to other thermostable polymerases. PFU supériorité de la polymérase La principale différence entre UMP et d'autres enzymes du PFU est supérieur thermostabilité et de «relecture» des propriétés par rapport à d'autres polymérases thermostable. Unlike Taq DNA polymerase, Pfu DNA polymerase possesses 3' to 5' exonuclease proofreading activity, meaning that it works its way along the DNA from the 3' end to the 5' end and corrects nucleotide-misincorporation errors. Contrairement à l'ADN polymérase Taq, PFU ADN polymérase possède 3 'à 5' activité exonucléase la correction d'épreuves, ce qui signifie qu'il travaille son chemin le long de l'ADN à partir de l'extrémité 3 'à 5' fin de nucléotides et corrige les erreurs-misincorporation. This means that Pfu DNA polymerase-generated PCR fragments will have fewer errors than Taq-generated PCR inserts. Cela signifie que l'ADN polymérase PFU-PCR généré aura moins d'erreurs que Taq-PCR a généré des inserts. As a result, Pfu is more commonly used for molecular cloning of PCR fragments than the historically popular Taq. En conséquence, PFU est plus communément utilisé pour le clonage moléculaire des fragments de PCR de la Taq historiquement populaires. Commercially available Pfu typically results in an error rate of 1 in 1.3 million base pairs and can yield 2.6% mutated products when amplifying 1kb fragments using PCR. Disponibles PFU résultats généralement en un taux d'erreur de 1 au 1.3 millions de paires de bases ne rendement et de 2,6% lorsque muté produits 1kb d'amplifier l'aide de fragments PCR. However, Pfu is slower and typically requires 1–2 minutes to amplify 1kb of DNA at 72° C. Using Pfu DNA polymerase in PCR reactions also results in blunt-ended PCR products. Toutefois, PFU est plus lent et nécessite généralement 1-2 minutes à 1kb amplifier de l'ADN à 72 ° C. En utilisant l'ADN polymérase PFU dans les réactions PCR également des résultats en mousse à composition non limitée de produits PCR. Pfu DNA polymerase is hence superior for techniques that require high-fidelity DNA synthesis, but can also be used in conjunction with Taq polymerase to obtain the fidelity of Pfu with the speed of Taq polymerase activity. PFU l'ADN polymérase est donc supérieur pour les techniques qui nécessitent une haute-fidélité synthèse de l'ADN, mais peut aussi être utilisé en conjonction avec la Taq polymérase d'obtenir la fidélité de l'UMP à la vitesse de la Taq polymérase activité.

History Histoire

Scientists associated with the biotech company Stratagene, based in La Jolla, California discovered the superiority of Pfu over Taq in 1991. Les scientifiques associés à l'entreprise de biotechnologie Stratagene, basée à La Jolla, en Californie, a découvert la supériorité de l'UMP sur Taq en 1991. They published their work in the journal Gene in December of that year (Gene. 1991 Dec 12;108(1):1-6). Ils ont publié leurs travaux dans la revue Gene en Décembre de la même année (Gene. 1991 décembre 12; 108 (1) :1-6). US Patent 5,489,523 was granted over exonuclease-deficient Pfu in February 1996 while US Patent 5,545,552 over Pfu itself was granted in August 1996. US Patent 5489523 a été accordée plus de exonucléase déficientes PFU en Février 1996 alors qu'il US Patent 5545552 PFU sur lui-même a été accordée en août 1996.

PCR Polymerases PCR Polymerases

Summary of Available PCR Polymerases and their properties. Résumé de la PCR Polymerases disponibles et leurs propriétés.

PCR and Polymerases PCR et Polymerases

PCR has been performed on DNA larger than 10 kilobases, however the average PCR is only several hundred to a few thousand bases of DNA. PCR a été réalisée sur l'ADN de plus de 10 kilobases, mais la moyenne est seulement PCR plusieurs centaines à quelques milliers de bases de l'ADN. The problem with long PCR is that there is a balance between accuracy and processivity of the enzyme. Le problème avec le PCR est qu'il existe un équilibre entre l'exactitude et processivity de l'enzyme. Usually, the longer the fragment, the greater the probability of errors. Habituellement, plus le fragment, la plus grande est la probabilité d'erreurs.

PCR Polymerases References PCR polymérases Références

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