PCR Dépannant
Problèmes de PCR et solutions, aide de PCR
Quel est votre problème de PCR ? :
Longs produits non spécifiques de PCR ?
Formation dimère mieux habillée ?
Longs produits non spécifiques dans PCR
En courant un gel d'agarose vous repèrez de plus grandes bandes non spécifiques de PCR qui ne sont pas les exactes classent.
Solutions à désirer ardemment produits non spécifiques dans PCR :
Diminuez le temps de recuit
Diminuez le temps de prolongation
Diminuez la température de prolongation à 62-68º C
Augmentez la concentration en KCl (amortisseur) à 1.2x-2x, mais gardez la concentration en mgcl2 à 1.5-2mM
Augmentez la concentration en mgcl2 jusqu'à 3-4.5 millimètres mais gardez la constante de concentration de dNTP.
Utilisez moins d'amorce
Prenez moins de calibre d'ADN
Prenez moins de polymérase de Taq
Si aucun des travaux ci-dessus : examinez l'amorce pour assurer les ordres réitérés (le SOUFFLE alignent l'ordre avec les bases de données) et changez le primer(s)
Combinaison de some/all de ce qui précède.
Problème :
Dimères D'Amorce de PCR
En courant un gel d'agarose, vous repèrez quelques bandes très petites de PCR. Ce sont la taille de votre amorce ou au sujet de la taille des deux vos amorces (A et B) ensemble. Celles-ci se nomment "les dimères mieux habillés" et sont constituées par le recuit de votre amorce avec elle-même ou avec l'autre amorce.
Solutions aux dimères mieux habillés dans PCR :
Utilisez moins d'amorce.
L'amorce de nouvelle conception et commandent un nouveau groupe. Vous assurez vous logiciel et contrôle de conception d'amorce d'utilisation pour art de l'auto-portrait-annealing et que les amorces ne partagent pas un grand pourcentage de l'ordre complémentaire. Examinez les amorces soigneusement pour assurer la formation de homo-dimère et de hetero-dimère avec OligoAnalyzer
Conduisez PCR avec et sans du formamide.
Titrez la concentration de Mg2+ (MgCl - 1.5, 2.0, 2.5 et 3.0 millimètres).
Augmentez la quantité de calibre d'ADN (concentration).
Augmentez la température de recuit (essai optimisant à l'aide d'une machine de gradient PCR pour trouver la température optimale pour le recuit).
Essayez d'ajouter DMSO jusqu'à 5%.
Essayez d'employer HotStart PCR au lieu de la polymérase régulière PCR de Taq.
Combinaison de some/all de ce qui précède.