RT-PCR
Renversez l'amplification en chaîne par réaction de transcription
L'amplification en chaîne par réaction renversée de transcription (RT-PCR) est basée sur l'amplification en chaîne par réaction (ACP). D'une manière primordiale elle est basée sur le processus de la transcription renversée, que l'inverse transcrit l'ARN en ADN et a été au commencement isolé dans des retroviruses.
Les techniques de RT-PCR permet la formation du cDNA (complémentaire ou de l'ADN de copie) de l'ARN, qui enregistre l'ordre de l'ARN (tel qu'ARN de messager, ADN messagère) sous la forme plus stable de l'acide nucléique, ADN. Cette transcription renversée de l'ARN dans son ADN renversée de complément (cDNA) est la première étape d'un processus habituellement en deux étapes de RT-PCR. En outre, en copiant l'ARN dans l'ADN, on peut alors amplifier l'ordre de cDNA en utilisant des amorces spécifiques pour l'ordre d'ADN. Cette amplification est la deuxième étape principale finale du processus en deux étapes de RT-PCR.
Le processus de RT-PCR
La première étape de RT-PCR est mentionnée comme la « première réaction de brin ». Dans la réaction de premier-brin, le cDNA également nommé complémentaire d'ADN, est fait à partir du descripteur d'ARN de messager d'intérêt utilisant le décollement oligo (poly-dTs acte d'oligonucléotide semblable aux amorces et au grippage aux 3 ' ordre de polyA situé aux 3 ' UTR - région non traduite, qui sont présents dans la plupart des mRNAs), dNTPs, et un ADN polymérase ARN-dépendant, renversent le transcriptase, par le processus de la transcription renversée.
Ces facteurs sont combinés dans une mémoire tampon renversée de transcriptase pour 1 heure à 37°C. Après que la réaction renversée de transcriptase soit complète, et le cDNA a été synthétisé, RNaseH est ajouté (une enzyme de digestion d'ARN) qui assimile l'ARN à partir de l'hybride d'ARN-cDNA. Après incubation avec RNaseH, l'ACP ou l'amplification en chaîne par réaction standard est conduit utilisant les amorces oligo d'ADN spécifiques pour l'ordre d'intérêt. Cette deuxième étape est mentionnée comme la « deuxième réaction de brin ».
Ainsi en ajoutant l'ADN polymérase Thermostable, les amorces ascendantes et descendant d'ADN, l'ADN échouée simple devient bicaténaire et est amplifiées, permettant la détection même des ordres rares ou bas de la copie ADN messagère en amplifiant son ADN complémentaire.
Applications de RT-PCR
L'amplification exponentielle de l'ordre complémentaire de l'ADN messagère ou les ordres d'ARN par l'intermédiaire de l'amplification en chaîne par réaction renversée de transcription tiennent compte d'une technique élevée de détection de sensibilité, où le bas nombre de copie ou les molécules moins abondantes d'ARN peut être détecté. Il est également employé pour copier des ordres d'ADN messagère sous forme d'ADN complémentaire, permettant aux bibliothèques du cDNA (bibliothèques de cDNA) d'être créées qui contiennent tous les ordres d'ADN messagère des gènes exprimés en cellule. En outre, il permet la création des éléments de cDNA qui ont été copiés par RT-PCR et permettent l'expression des gènes aux niveaux d'ARN et de protéine pour davantage d'étude.