RT-PCR
Renversez La Réaction en chaîne De Polymérase De Transcription
La réaction en chaîne de polymérase renversée de transcription (RT-PCR) est basée sur la réaction en chaîne de polymérase (PCR). D'une manière primordiale elle est basée sur le processus de la transcription renversée, que l'inverse transcrit l'ARN en ADN et a été au commencement isolé dans des retroviruses.
Les techniques de RT-PCR permet la formation de l'ADN (complémentaire ou de l'ADN de copie) de l'ARN, qui stocke l'ordre de l'ARN (tel que l'ARN, le mRNA de messager) sous la forme plus stable d'acide nucléique, ADN. Cette transcription renversée de l'ARN dans sa ADN renversée de complément (ADN) est la première étape d'un processus habituellement en deux étapes de RT-PCR. En outre, en copiant l'ARN dans l'ADN, on peut alors amplifier l'ordre d'ADN en utilisant des amorces spécifiques pour l'ordre d'ADN. Cet amplification est la deuxième étape principale finale du processus en deux étapes de RT-PCR.
Le processus de RT-PCR
La première étape de RT-PCR est mentionnée comme la "première réaction de rive". Dans la réaction de premier-rive, l'ADN également nommée d'ADN complémentaire, est faite à partir du calibre d'ARN de messager d'intérêt en utilisant le décollement d'oligo (poly-dTs acte d'oligonucléotide semblable aux amorces et au grippage 'ordre de polyA aux 3 situé au 3'UTR - région non traduite, qui sont présents dans la plupart des mRNAs), dNTPs, et une polymérase ARN-DÉPENDANTE d'ADN, renversent le transcriptase, par le processus de la transcription renversée.
Ces facteurs sont combinés dans un amortisseur renversé de transcriptase pour 1 heure à 37°C. Après que la réaction renversée de transcriptase soit complète, et l'ADN a été synthétisée, RNaseH est ajouté (une enzyme de digestion d'ARN) qui digère l'ARN loin de l'hybride ARN-ADN. Après incubation avec RNaseH, la réaction en chaîne standard de PCR ou de polymérase est conduite à l'aide des amorces d'oligo d'ADN spécifiques pour l'ordre d'intérêt. Cette deuxième étape est mentionnée comme la "deuxième réaction de rive".
Ainsi en ajoutant la polymérase thermostable d'ADN, les amorces ascendantes et descendant d'ADN, l'ADN échouée simple devient double échoué et est amplifiées, permettant la détection de même ordres rares ou bas de mRNA de copie en amplifiant sa ADN complémentaire.
Applications de RT-PCR
L'amplification exponentiel de l'ordre complémentaire du mRNA ou les ordres d'ARN par l'intermédiaire de la réaction en chaîne de polymérase renversée de transcription tiennent compte d'une technique élevée de détection de sensibilité, où le bas nombre de copie ou les molécules moins abondantes d'ARN peut être détecté. Il est également employé pour copier des ordres de mRNA sous forme d'ADN complémentaire, permettant aux bibliothèques d'ADN (bibliothèques d'ADN) d'être créées qui contiennent tous les ordres de mRNA des gènes exprimés en cellule. En outre, il permet la création des constructions d'ADN qui ont été copiées par RT-PCR et permettent l'expression des gènes aux niveaux d'ARN et de protéine pour davantage d'étude.