Colonia PCR
Che cosa è colonia PCR?
La definizione della colonia PCR è:
La colonia PCR la selezione di batterico (E.Coli) o del lievito clona per i prodotti corretti del plasmide o di ligation. Le colonie selezionate dei batteri o del lievito sono selezionate con una punta sterile della pipetta o del toothpick da una piastra di sviluppo (agarosi). Ciò allora è inserita nella miscela del padrone di PCR o pre-è inserita in acqua sterilizzata nell'autoclave. PCR allora è condotto per determinare se la colonia contiene il frammento del DNA o il plasmide di interesse.
Protocollo Batterico Della Colonia PCR Di E.Coli
Metodo Rapido Della Preparazione Della Colonia PCR
Punto 1:
Selezioni una colonia batterica con una punta sterilizzata nell'autoclave della pipetta o del toothpick e turbini esso in 25 μl di dH2O sterilizzato nell'autoclave TE in un tubo sterilizzato nell'autoclave del microfuge. Non rimuova l'intera colonia e contrassegni la zona che avete selezionato preferrably il numero la parte inferiore della piastra (e del tubo del microfuge).
Punto 2:
Riscaldi la miscela in un d'acqua bollente o il blocchetto
caldo del heating (90-100C) per 2 minuti
Punto 3:
Fili il campione per 2 minuti ad alta velocità nella centrifuga.
Punto 4:
Trasferisca 20 μl del galleggiante in un nuovo tubo del microfuge.
Punto 5:
Prenda 1-2 μl del galleggiante come mascherina nelle 25 μl reazione standard di PCR PCR.
Protocollo Della Colonia PCR Del Lievito
Prenda le cellule del lievito che si sono sviluppate su una piastra fresca dall'incubatrice 37C (il lievito di recente sviluppato è migliore)
Prenda una punta sterilizzata nell'autoclave della pipetta o del toothpick e tocchi l'un po'di colonia del lievito. Non raschi via una colonia intera. Sospendalo in un mastermix standard di PCR.
Stati Ciclanti di PCR:
Primo Punto Denaturante: 95 °C, 5 minuti
Denaturare Punto: 95 °C, 30 sec
Punto Di Ricottura: 50-55 °C, 30 sec
Punto Di Estensione: 72 °C, 1min/kb
Ripeti il puntola s 2-4: 34 volte
Estensione Finale: 72 °C, 3 minuti
Carichi l'intera reazione di PCR sul gel dell'agarosi di 1%.
Colonia PCR - Ricerca Pubblicata Pubmed
PCR diretto dei batteri intatti (colonia PCR). Articoli Relativi
PCR diretto dei batteri intatti (colonia PCR).
Microbiologia Di Curr Protoc. May;Appendix 2008 3:Appendix 3D
Autori: Woodman ME
Questo protocollo descrive un metodo efficiente per selezionare i batteri intatti per la presenza delle sequenze volute del DNA usando la reazione a catena della polimerasi (PCR). Questo metodo si riferisce a comunemente come colonia PCR.
PMID: 18770531 [ PubMed - in lavorazione ]