PCR in situ
Definizione della PCR in situ
La PCR in situ (ISH) è una reazione a catena della polimerasi che realmente avviene all'interno della cella su una trasparenza. L'amplificazione in situ di PCR può essere effettuata sul tessuto o sulle celle fisso.
Introduzione in situ di PCR
Durante l'inizio e la progressione della malattia, le quantità minuscole di prodotto in piccole popolazioni delle celle o i tessuti possono essere vitali per la patogenesi della malattia.
In molte malattie lento-evolventesi che richiedono i mesi o persino gli anni per manifestarsi clinicamente, è stato indicato che la maggior parte della popolazione commovente delle cellule è in una condizione transcriptionally inattiva e ad un livello di un gene per cellula ospite.
I metodi di ibridazione dell'acido nucleico e la reazione a catena della polimerasi (PCR) entrambi sono stati impiegati per esaminare l'espressione e la rilevazione di tali geni commoventi durante la patogenesi. Mentre entrambe queste tecniche sono abbastanza utili, lo svantaggio di queste tecniche è che essenzialmente stanno intraprendendo gli studi di espressione e della popolazione delle cellule. Gli acidi nucleici sono isolati da una popolazione delle celle che contiene un numero sufficiente delle molecole per rilevare direttamente mediante tecniche standard di ibridazione, o, quando una sottopopolazione contiene così piccolo come singola copia di acido nucleico, da quella molecola amplificata dalla PCR e rilevata dopo l'amplificazione.
L'ibridazione in situ (ISH) applica la metodologia della tecnica di ibridazione dell'acido nucleico al livello cellulare. La combinazione la citochimica e della PCR immunocytochemistry e in situ permette che l'identificazione degli indicatori cellulari sia identificata e più ulteriormente che consente la localizzazione alle sequenze specifiche delle cellule all'interno delle popolazioni delle cellule, quali i tessuti ed i campioni di sangue.
La PCR in situ è limitata alla rilevazione di materiale non-genomic quali RNA, i geni o i genoma, poichè il limite di segnalazione nella maggior parte delle circostanze è parecchie copie dell'acido nucleico dell'obiettivo per cella. Di conseguenza, dovuto le limitazioni di numero di copia, ibridazione di RNA è più sensibile della rilevazione del DNA.
I fattori che interessano la sensibilità in situ di PCR includono:
1) lo strandedness della molecola dell'obiettivo
2) la mancanza di sequenza complementare prossimale alle sequenze dell'obiettivo
Inverta la trascrizione in situ transcriptase-catalizzata persino è stato usato per rilevare RNAs che si presentano al numero di copia relativamente alto.
PCR in situ (ISH) Protcol
Inizialmente la stechiometria delle componenti di acido nucleico fa la reazione iniettore-guidata. Mentre la reazione continua tuttavia, il prodotto in se di PCR comincia a funzionare come obiettivo per ulteriore amplificazione, così come un iniettore per ulteriore allungamento. È l'accumulazione delle sequenze prolungate nelle reazioni multiple che è mantenuta dalla cella fissa e funge da obiettivo per la sonda radioattiva nella fase di rilevazione.
La natura fisica complessa all'interno di una cella fissa impedice sia il risparmio di temi della polimerasi così come la diffusione che la ricottura ed i tempi di allungamento sono così molto più lunghi di quelli condotti negli stati acquosi (PCR standard). Il segnale ottimale producted solitamente usando un allungamento minuto 15.