PCR In situ
Definizione di PCR in situ
PCR in situ (ISH) è una reazione a catena della polimerasi che realmente avviene all'interno della cellula su uno scorrevole. L'amplificazione in situ di PCR può essere effettuata sul tessuto o sulle cellule fisso.
Introduzione In situ di PCR
Durante l'inizio e la progressione della malattia, le quantità minuscole di prodotto in piccole popolazioni delle cellule o i tessuti possono essere vitali per la patogenesi della malattia.
In molte malattie d'evoluzione che richiedono i mesi o persino gli anni per manifestarsi clinicamente, è stato indicato che la maggior parte della popolazione affected delle cellule è transcriptionally in un inattivo dichiara e ad un livello di un gene per la cellula ospite.
I metodi di ibridazione dell'acido nucleico e la reazione a catena della polimerasi (PCR) entrambi sono stati impiegati per esaminare l'espressione e la rilevazione di tali geni affected durante la patogenesi. Mentre entrambe queste tecniche sono abbastanza utili, lo svantaggio di queste tecniche è che essenzialmente stanno intraprendendo gli studi di espressione e della popolazione delle cellule. Gli acidi nucleici sono isolati da una popolazione delle cellule che contiene un numero sufficiente di molecole per rilevare direttamente mediante tecniche standard di ibridazione, o, quando una sottopopolazione contiene così piccolo come singola copia di acido nucleico, da quella molecola amplificata dal PCR e rilevata dopo l'amplificazione.
L'ibridazione in situ (ISH) applica la metodologia della tecnica di ibridazione dell'acido nucleico al livello cellulare. PCR in situ cytochemistry ed immunocytochemistry di combinazione, permette che l'identificazione degli indicatori cellulari sia identificata e più ulteriormente che consente la localizzazione alle sequenze specifiche delle cellule all'interno delle popolazioni delle cellule, quali i tessuti ed i campioni di anima.
PCR in situ è limitato alla rilevazione di materiale non-genomic quali RNA, i geni o i genomes, poichè il limite di segnalazione nella maggior parte delle circostanze è parecchie copie dell'acido nucleico dell'obiettivo per la cellula. Di conseguenza, dovuto le limitazioni di numero della copia, ibridazione di RNA è più sensibile della rilevazione del DNA.
I fattori che interessano la sensibilità in situ di PCR includono:
1) lo strandedness della molecola dell'obiettivo
2) la mancanza di sequenza complementare prossimale alle sequenze dell'obiettivo
Inverta la trascrizione in situ transcriptase-catalizzata persino è stato usato rilevare RNAs che si presentano al numero relativamente alto della copia.
PCR In situ (ISH) Protcol
Inizialmente la stechiometria dei componenti dell'acido nucleico fa la reazione iniettore-guidata. Mentre la reazione continua tuttavia, il prodotto in se di PCR comincia a funzionare come obiettivo per ulteriore amplificazione, così come un iniettore per ulteriore allungamento. È l'accumulazione delle sequenze prolungate nelle reazioni multiple che è mantenuta dalla cellula fissa e funge da obiettivo per la sonda radioattiva nella fase di rilevazione.
La natura fisica complessa all'interno di una cellula fissa impedisce sia l'efficienza della polimerasi così come diffusione che la ricottura ed i tempi di allungamento sono così molto più lunghi di quelli condotti negli stati acquosi (PCR standard). Il segnale ottimale è solitamente producted usando un allungamento minuto 15.