PCR Inverso
Priorità bassa Inversa di PCR
PCR inverso inoltre ha denominato IPCR ed in primo luogo è stato descritto da Ochman ed altri in 1988 (1).
Una limitazione di PCR standard è che le regioni
fiancheggianti 5'e 3'del vostro frammento del DNA di interesse devono
essere conosciute. PCR inverso permette che conduciate PCR
quando avete soltanto le informazioni di una sequenza interna.
La reazione a catena della polimerasi inversa è una variante di PCR ed è usata quando soltanto una sequenza interna del DNA dell'obiettivo è conosciuta. È quindi molto utile nell'identificare le sequenze fiancheggianti del DNA degli inserti genomic. Simile ad altri metodi di PCR, PCR inverso amplifica il DNA dell'obiettivo usando la polimerasi del DNA.
PCR inverso usa PCR standard (reazione a catena della
polimerasi), comunque fa orientare gli iniettori nel senso
d'inversione dell'orientamento usuale. La mascherina per gli
iniettori d'inversione è un frammento di limitazione che si è legato
su se per formare un cerchio.
Il Metodo Inverso di PCR
Il metodo inverso di PCR include una serie di digestioni e di auto-self-ligations con il DNA che è tagliato da un endonuclease di limitazione. Questo taglio provoca una sequenza conosciuta a la una o la altra conclusione delle sequenze sconosciute.
Punti Inversi di PCR
1) il DNA dell'obiettivo è tagliato leggermente
in più piccoli frammenti di parecchi kilobases tramite digestione del
endonuclease di limitazione.
2) il Auto-self-ligation è indotto sotto le concentrazioni
basse che inducono la base del fosfato a riformare. Ciò dà un
prodotto circolare di ligation del DNA.
3) il DNA dell'obiettivo è allora limitazione digerita con un
endonuclease conosciuto. Ciò genera un taglio all'interno della
sequenza interna conosciuta che genera un prodotto lineare con le
sequenze terminali conosciute. Ciò può ora essere usata per
PCR (reazione a catena della polimerasi).
4) PCR standard è condotto con gli iniettori complementari alle
sequenze interne ora conosciute.
Ricapitolando:
PCR inverso funziona per clonare le sequenze che fiancheggiano una sequenza conosciuta. Le sequenze fiancheggianti del DNA sono digerite ed allora si legano per generare il DNA circolare.
Gli iniettori di PCR che indicano via dalle sequenze
conosciute allora sono impiegati per amplificare le sequenze
fiancheggianti.
Applicazioni di PCR inverso
PCR inverso ha le applicazioni numerose nella biologia molecolare compreso l'amplificazione e l'identificazione delle sequenze che fiancheggiano gli elementi transposable e l'identificazione degli inserti genomic.
Protocollo Inverso di PCR
Riferimenti Inversi di PCR
1. Ochman H, Gerber COME, Hartl DL. La genetica. 1988 Nov;120(3):621-3.