PCR inversa
Priorità bassa inversa di PCR
La PCR inversa egualmente ha chiamato IPCR ed in primo luogo è stata descritta da Ochman ed altri in 1988 (1).
Una limitazione della PCR standard è che 5 ' e 3 ' regioni di fiancheggiamento di vostro frammento del DNA di interesse devono essere conosciute. La PCR inversa permette che conduciate la PCR quando avete soltanto le informazioni di una sequenza interna.
La reazione a catena inversa della polimerasi è una variante della PCR ed è usata quando soltanto una sequenza interna del DNA dell'obiettivo è conosciuta. È quindi molto utile nell'identificazione delle sequenze di fiancheggiamento del DNA degli inserti genomic. Simile ad altri metodi di PCR, la PCR inversa amplifica il DNA dell'obiettivo usando la polimerasi di DNA.
La PCR inversa usa la PCR standard (reazione a catena della polimerasi), comunque fa orientare gli iniettori nel senso d'inversione dell'orientamento usuale. Il modello per gli iniettori d'inversione è un frammento di limitazione che è stato legato su se per formare un cerchio.
Il metodo inverso di PCR
Il metodo inverso di PCR comprende una serie di digestioni e di auto-legature con il DNA che è tagliato da un endonucleasi di limitazione. Questo taglio provoca una sequenza conosciuta a la una o la altra conclusione delle sequenze sconosciute.
Punti inversi di PCR
1) il DNA dell'obiettivo è tagliato leggermente in più piccoli frammenti di parecchi kilobasi tramite digestione dell'endonucleasi di limitazione.
2) la Auto-legatura è indotta nell'ambito delle concentrazioni basse che inducono la spina dorsale del fosfato a riformare. Ciò dà un prodotto circolare di legatura del DNA.
3) il DNA dell'obiettivo è allora limitazione digerita con un endonucleasi conosciuto. Ciò genera un taglio all'interno della sequenza interna conosciuta che genera un prodotto lineare con le sequenze terminali conosciute. Ciò può ora essere usata per la PCR (reazione a catena della polimerasi).
4) la PCR standard è condotta con gli iniettori complementari alle sequenze interne conosciute now.
In breve:
La PCR inversa funziona per clonare le sequenze che fiancheggiano una sequenza conosciuta. Le sequenze di fiancheggiamento del DNA si digeriscono ed allora sono legate per generare il DNA circolare.
Gli iniettori di PCR che indicano a partire dalle sequenze conosciute allora sono impiegati per amplificare le sequenze di fiancheggiamento.
Applicazioni della PCR inversa
La PCR inversa ha le numerose applicazioni nella biologia molecolare compreso l'amplificazione e l'identificazione delle sequenze che fiancheggiano gli elementi commutabili e l'identificazione degli inserti genomic.
Protocollo inverso di PCR
Riferimenti inversi di PCR
1. Ochman H, Gerber COME, Hartl DL. La genetica. 1988 novembre; 120 (3): 621-3.