Clonazione di PCR
Prodotti di PCR della clonazione
Se volete clonare un frammento di DNA in un plasmide o in una costruzione, uno dei modi più facili fare questo sta usando la PCR. Se avete il frammento o gene del DNA già in un plasmide ed i luoghi di limitazione che fiancheggiano il frammento sono compatibili con il nuovo plasmide che volete clonarli in, la digestione degli enzimi di limitazione funziona solitamente bene.
Tuttavia, se volete costruire i nuovi luoghi di limitazione per il frammento, costruire le omissioni con frammento, o subire una mutazione i luoghi all'interno del DNA, la reazione a catena della polimerasi o di PCR del frammento del DNA è uno dei modi più facili e migliori clonare il vostro frammento usando la PCR.
Progettazione degli iniettori per la clonazione di PCR
Gli iniettori per la clonazione di PCR sono solitamente più lunghi a causa della necessità di aggiungere i luoghi di limitazione.
I luoghi di limitazione sono solitamente 6 B.P. di lunghezza. Se non stiate andando al subclone il prodotto di PCR, dovete aggiungere i nucleotidi 5 ' del luogo di limitazione
Ciò permette che l'enzima di limitazione leghi a e tagli il luogo di limitazione per essere più efficiente.
Sequenza dell'iniettore del luogo di limitazione del distanziatore (progettata dal programma dell'iniettore)
3 B.P. --6bp 15-22 B.P.
PCR Subcloning
(Subclone significa clonare il prodotto di PCR in un vettore prima che lo inseriate nel vostro vettore di interesse. I vantaggi di questo comprende il fatto che non dovete mai ancora PCR il vostro inserto, voi sempre lo avranno nel frigorifero e potete coltivare in su tanto come volete usando i batteri.)
Dalla nostra esperienza, tagliare i prodotti di PCR è solitamente molto meno efficiente che i frammenti di taglio dai vettori. Quindi, tagliare i prodotti di PCR e clonarli nel vostro vettore direttamente non possono essere efficiente e voi potete che la difficoltà fare questa.
Quello è modo che subcloning in un vettore subcloning è solitamente il la cosa migliore.
Vettori di TOPO
I vettori di TOPO sono grandi per subcloning, anche se possono essere costosi. Lo salveranno a lungo termine tempo e rendono i prodotti di PCR della clonazione più facili e più efficienti.
Il motivo per questo è che potete digerire facilmente il DNA in un plasmide. È più efficiente per l'enzima di limitazione poichè può legare facilmente a e digerire la vostra parte.
Gli svantaggi sono che dovete avere stati efficienti ed ottimizzati di PCR. La presenza di molte fasce nella vostra PCR gli renderà se non impossible difficile clonare il vostro prodotto di PCR di interesse.
Potete solitamente subclone il vostro prodotto di PCR in circa i 2 giorni. La legatura richiede soltanto 5 minuti e potete placcare le vostre colonie batteriche il giorno della legatura. Una volta che selezionate le colonie il next day e le coltivate nei media, non solo amplificate il vostro inserto, voi egualmente ora avete una colonia batterica del vostro inserto subcloned che potete congelare con glicerolo nell'azoto liquido per gli anni.
Ciò realmente aiuta quando dovete fare un'altra costruzione con il vostro inserto!