ENZIMI DI PCR: Polimerasi di PCR

Polimerasi di PCR - l'ultima guida

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Polimerasi di PCR: Un'introduzione

La scelta della polimerasi di DNA impiegata dalla PCR è determinata dagli obiettivi dell'esperimento. Ci ora è una pletora di enzimi disponibili nel commercio da scegliere dal quel differisce nella loro stabilità termica, processivity e fedeltà. L'enzima più comunemente usato ed il più estesamente studiato è la polimerasi di DNA di Taq.

Polimerasi iniziali di PCR

Le polimerasi di DNA utilizzate originale nelle prime reazioni di PCR sono state estratte dal batterio Escherichia coli. Anche se questo enzima era perfino oggi uno strumento inestimabile per molti usi di ricerca di biologia molecolare nel passato e, ha presentato molti svantaggi nella PCR originale. Nella PCR, la reazione di PCR deve essere denaturata riscaldando il prodotto double-stranded del DNA dopo ogni ciclo. Purtroppo, riscaldando anche irreversibilmente ha inattivato la polimerasi di DNA di Escherichia coli. Le aliquote fresche dell'enzima hanno dovuto aggiungersi manualmente all'inizio di ogni ciclo. Con 30-40 cicli della PCR, questa era un'operazione molto laboriosa e noiosa.

Che cosa è stato richiesto era una polimerasi di DNA che rimanente stabile durante l'operazione di denaturazione del DNA effettuata a 90°C o vibra. Una scoperta ha reso la soluzione molto più facile. Il aquaticus termofilo del batterio è stato isolato a partire dalle molle calde dell'acqua. Questo batterio poteva sopravvive a e prolifera nelle temperature dell'acqua estremamente alte delle molle calde. L'isolamento della polimerasi di DNA da questo batterio ha reso una polimerasi di PCR che non è stata inattivata velocemente alle temperature elevate. Gelfand ed altri alla società di Cetus con successo ha purificato e clonato questa polimerasi ora chiamata di Taq della polimerasi di PCR (aquaticus termofilo in breve).

Ciò ha conceduto 30-40 cicli dell'amplificazione di PCR da effettuare senza la necessità di aprire il tubo di reazione di PCR e di aggiungere la polimerasi fresca. Questa contaminazione potenziale anche riduttrice che potrebbe essere introdotta quando aggiunge la polimerasi manualmente oltre 20-30 cronometra nelle reazioni originali di PCR. Inoltre, dovuto la natura del batterio termofilo e della polimerasi, Taq ha funzionato ottimamente alle temperature intorno a 72°C, permettendo che la sintesi del DNA sia effettuata a molto più su
temperature possibile con l'enzima di Escherichia coli. Ciò ha presentata il vantaggio di permettere che il filo del DNA del modello sia copiato ad una fedeltà molto più alta dovuto l'più alto strigency della ricottura dell'iniettore di PCR. Questo ulteriori prodotti non specifici riduttori che avévano interessato molte reazioni più iniziali di PCR.

Polimerasi di DNA di TAQ

La polimerasi anche “Taq„ semplicemente chiamato di Taq, è una polimerasi di DNA termostabile utilizzata nella reazione a catena della polimerasi (PCR) per catalizzare la reazione della replica del DNA nel ciclo di PCR. In questo modo dell'amplificazione, la PCR può esaminare per la presenza o l'assenza di gene di interesse in un campione biologico.

Polimerasi di DNA di Taq

Modello molecolare della polimerasi di DNA di Taq. La struttura di cristallo della DNA-Polimerasi di Taq mostra un nuovo orientamento per il settore della nucleasi di Struttura-Specific.

La polimerasi di DNA di Taq ha sostituito la polimerasi di DNA di Escherichia coli nella PCR, dovuto le relative proprietà termostabili. Taq in primo luogo è stato isolato dal aquaticus di Thermus, un batterio che vive nelle molle calde e nei passaggi idrotermici.

Taq era la prima polimerasi che poteva sostenere denaturare condiziona (oltre °C) 90 richiesto durante il riciclaggio di PCR.

Taq ha un periodo radioattivo nzymatic di e a 95°C di circa 40 min. Per più proprietà di Taq, vedi la tabella qui sotto.

Uno degli svantaggi importanti delle polimerasi di Taq è la relativa fedeltà bassa della replica. Poichè Taq non ha exonuclease a 3 ' 5 ' correggere le bozze del meccanismo per sostituire un disadattamento accidentale nel filo recentemente sintetizzato del DNA, Taq produce più errori che correggendo le bozze delle polimerasi quale Pfu.

La polimerasi di DNA di Taq egualmente è unica in quanto produce i prodotti di PCR con le sporgenze di A (adenina). Ciò è stata trovata per essere abbastanza utile ed è stata sfruttata per produrre la clonazione dell'AT e la clonazione di TOPO (Invitrogen). Questi metodi impiegano un vettore della clonazione (o plasmide) che possiede le sporgenze di T (Thymine). Ciò permette la legatura usando il topoisomerase o la ligasi del DNA da compire rapidamente con le sporgenze di A del prodotto di PCR

Polimerasi di DNA di PFU

La polimerasi di DNA di Pfu è un enzima trovato nel furiosus ipertermofilo di Pyrococcus del archaeon, dove funziona in vivo per ripiegare il DNA dell'organismo. In vitro, Pfu è usato per amplificare rapidamente il DNA nella reazione a catena della polimerasi, dove l'enzima servisce la funzione centrale di copiatura del filo nuovo di DNA durante l'ogni punto di estensione.

La superiorità della polimerasi di Pfu la differenza principale fra Pfu e gli enzimi alternativi è la termostabilità superiore del Pfu e “correggere le bozze„ delle proprietà confrontate ad altre polimerasi termostabili. Diverso della polimerasi di DNA di Taq, la polimerasi di DNA di Pfu possiede il exonuclease a 3 ' 5 ' che corregge le bozze dell'attività, significante che funziona il relativo modo lungo il DNA dall'estremità ai 3 ' conclusione 5 ' e corregge gli errori del nucleotide-misincorporation. Ciò significa che i frammenti di PCR polimerasi-generati DNA di Pfu avranno pochi errori di quanto gli inserti Taq-generati di PCR. Di conseguenza, Pfu è usato più conunemente per clonazione molecolare dei frammenti di PCR che il Taq storicamente popolare. Pfu disponibile nel commercio provoca tipicamente un tasso di errore di 1 in 1.3 milione accoppiamenti bassi e può rendere 2.6% prodotti mutati quando 1kb d'amplificazione spezzetta usando la PCR. Tuttavia, Pfu è più lento e tipicamente richiede 1-2 minuti per amplificare 1kb di DNA a 72° C. Utilizzando la polimerasi di DNA di Pfu nelle reazioni di PCR egualmente provoca i prodotti smussato-conclusi di PCR. La polimerasi di DNA di Pfu è quindi superiore per le tecniche che richiedono la sintesi high-fidelity del DNA, ma può anche essere usata insieme con la polimerasi di Taq per ottenere la fedeltà di Pfu con velocità di attività della polimerasi di Taq.

Storia

Gli scienziati si sono associati con l'azienda Stratagene di Biotech, basato a La Jolla, la California hanno scoperto la superiorità di Pfu sopra Taq in 1991. Hanno pubblicato la loro opera nel gene del giornale in dicembre di quell'anno (gene. 12 dicembre 1991; 108 (1): 1-6). Gli Stati Uniti Il brevetto 5.489.523 è stato assegnato sopra Pfu exonuclease-carente nel febbraio 1996 mentre il brevetto 5.545.552 degli Stati Uniti sopra Pfu in se è stato assegnato nell'agosto 1996.

Polimerasi di PCR

Sommario delle polimerasi disponibili di PCR e delle loro proprietà.

Polimerasi di DNA	Sorgente biologica	5 '--3 ' Exonuclease Attività	3 '--5 ' Exonuclease Attività	95°C periodo radioattivo (minuto)	Nomi commerciali	Aziende di fornitura	Tasso di estensione (nucleosides/s)	Tasso di errore	Tempo (s) a 1kb (72°C)
Taq	Thermus Aquaticus	+	-	40	AmpliTaq, oro di AmpliTaq	Promega, Roche, Invitrogen e molti altri.	75	1 in 10^3	32
Pfu	Furiosus di Pyrococcus	-	+	120	PfuTurbo	Stratagene, Fermentas, Invitrogen tra l'altro	60	1 in 1.3 x 10^6	60-120
Pwo	Woesei di Pyrococcus	-	+	N/A			N/A	N/A	N/A
Tfl	Thermas flavus	-	-
rTth	Themus termofilo	+	-	20
Tli	Litoris di Thermus	-	+	400	Sfiato
Tma	Maritima di Thermotoga	-	+	>50

PCR e polimerasi

La PCR è stata effettuata su DNA più grandi di 10 kilobasi, comunque la PCR media è soltanto diverse centinaia ad alcune mille basi di DNA. Il problema con la PCR lunga è che ci è un equilibrio fra esattezza e il processivity dell'enzima. Solitamente, più lungo il frammento, maggior la probabilità degli errori.

Tipi di PCR

Risorse di PCR