RT-PCR
Inverta La Reazione a catena Della Polimerasi Della Trascrizione
La reazione a catena della polimerasi d'inversione della trascrizione (RT-PCR) è basata sulla reazione a catena della polimerasi (PCR). È basata più d'importanza sul processo di trascrizione d'inversione, che l'inverso trascrive il RNA in DNA ed inizialmente è stato isolato dai retroviruses.
Le tecniche di RT-PCR permette la formazione di DNA (complementare o del DNA della copia) da RNA, che immagazzina la sequenza di RNA (quali il RNA, il mRNA del messaggero) nella forma più stabile di acido nucleico, DNA. Questa trascrizione d'inversione da RNA nel relativo DNA d'inversione del complemento (DNA) è il primo punto di un processo solitamente in due tappe di RT-PCR. Ancora, copiando il RNA in DNA, uno può allora amplificare la sequenza del DNA usando gli iniettori specifici per la sequenza del DNA. Questa amplificazione è il secondo punto principale finale del processo in due tappe di RT-PCR.
Il processo di RT-PCR
Il primo punto di RT-PCR si riferisce a come "la prima reazione del filo". Nella reazione del primo-filo, il DNA anche chiamato del DNA complementare, è fatto dalla mascherina del RNA del messaggero di interesse usando il distacco di oligo (poli-dTs atto simile agli iniettori ed alla legatura 'sequenza di polyA ai 3 situata al 3'UTR - regione non tradotta, che sono presenti nella maggior parte dei mRNAs), dNTPs del oligonucleotide e una polimerasi RNA-DIPENDENTE del DNA, inverte il transcriptase, con il processo di trascrizione d'inversione.
Questi fattori sono uniti in un amplificatore d'inversione di transcriptase per 1 ora a 37°C. Dopo che la reazione d'inversione di transcriptase sia completa ed il DNA sia sintetizzato, RNaseH è aggiunto (un enzima di digestione del RNA) che digerisce il RNA via dall'ibrido RNA-DNA. Dopo incubazione con RNaseH, la reazione a catena standard della polimerasi o di PCR è condotta per mezzo degli iniettori di oligo del DNA specifici per la sequenza di interesse. Questo secondo punto si riferisce a come "la seconda reazione del filo".
Così aggiungendo la polimerasi termostabile del DNA, gli iniettori verso l'alto e downstream del DNA, il singolo DNA incagliato si transforma in in doppio incagliato ed è amplificato, permettendo la rilevazione di persino sequenze rare o basse di mRNA della copia amplificando il relativo DNA complementare.
Applicazioni di RT-PCR
L'amplificazione esponenziale della sequenza complementare del mRNA o le sequenze del RNA via reazione a catena della polimerasi d'inversione della trascrizione tiene conto un'alta tecnica di rilevazione di sensibilità, dove il numero basso della copia o le molecole meno abbondanti del RNA può essere rilevata. Inoltre è usato per clonare le sequenze di mRNA sotto forma di DNA complementare, permettendo che le biblioteche di DNA (biblioteche del DNA) siano generate che contengono tutte le sequenze di mRNA dei geni espressi in una cellula. Ancora, permette la creazione delle costruzioni del DNA che sono state clonate da RT-PCR e permettono l'espressione dei geni ai livelli della proteina e del RNA per ulteriore studio.