RT-PCR
Inverta la reazione a catena della polimerasi della trascrizione
La reazione a catena d'inversione della polimerasi della trascrizione (RT-PCR) è basata sulla reazione a catena della polimerasi (PCR). È basata più d'importanza sul processo di trascrizione d'inversione, che l'inverso trascrive il RNA in DNA ed inizialmente è stato isolato dai retroviruses.
Le tecniche di RT-PCR permette la formazione di cDNA (complementare o di DNA della copia) da RNA, che memorizza la sequenza di RNA (quale il RNA di messaggero, mRNA) nel modulo più stabile di acido nucleico, DNA. Questa trascrizione d'inversione da RNA nel relativo DNA d'inversione del complemento (cDNA) è il primo punto di un processo solitamente in due tappe di RT-PCR. Ancora, copiando il RNA in DNA, uno può allora amplificare la sequenza del cDNA usando gli iniettori specifici per la sequenza del DNA. Questa amplificazione è il secondo punto principale finale del processo in due tappe di RT-PCR.
Il processo di RT-PCR
Il primo punto di RT-PCR si riferisce a come “la prima reazione del filo„. Nella reazione del primo-filo, il cDNA anche chiamato complementare del DNA, è fatto dal modello del RNA di messaggero di interesse usando il distacco oligo (poli-dTs atto simile agli iniettori ed alla legatura ai 3 ' sequenza situata ai 3 ' UTR - regione non tradotta di polyA, che sono presenti nella maggior parte dei mRNAs), dNTPs del oligonucleotide e una polimerasi di DNA RNA-dipendente, inverte il transcriptase, con il processo di trascrizione d'inversione.
Questi fattori sono uniti in un buffer d'inversione di transcriptase per 1 ora a 37°C. Dopo che la reazione d'inversione di transcriptase è completa e il cDNA è stato sintetizzato, RNaseH si aggiunge (un enzima di digestione del RNA) che digerisce il RNA a partire dall'ibrido del RNA-cDNA. Dopo incubazione con RNaseH, la PCR standard o la reazione a catena della polimerasi è condotta per mezzo degli iniettori oligo del DNA specifici per la sequenza di interesse. Questo secondo punto si riferisce a come “la seconda reazione del filo„.
Così aggiungendo la polimerasi di DNA termostabile, gli iniettori verso l'alto ed a valle del DNA, il singolo DNA incagliato si trasforma in in doppio incagliato ed è amplificato, permettendo la rilevazione delle persino sequenze rare o basse del mRNA della copia amplificando il relativo DNA complementare.
Applicazioni di RT-PCR
L'amplificazione esponenziale della sequenza complementare del mRNA o le sequenze del RNA via reazione a catena d'inversione della polimerasi della trascrizione tiene conto un'alta tecnica di rilevazione di sensibilità, dove il numero di copia basso o le molecole meno abbondanti del RNA può essere rilevata. Egualmente è usato per clonare le sequenze del mRNA sotto forma di DNA complementare, permettendo che le librerie di cDNA (librerie del cDNA) siano create che contengono tutte le sequenze del mRNA dei geni espressi in una cella. Ancora, permette la creazione delle costruzioni del cDNA che sono state clonate da RT-PCR e permettono l'espressione dei geni ai livelli della proteina e del RNA per ulteriore studio.