コロニーPCR

コロニーPCR は何であるか。

コロニー PCR の定義は 次のとおりである:

コロニーPCR は正しいligation またはプラスミッドプロダクトのために細菌(E.Coli) またはイーストのスクリーニングクローンとして作る。細菌の指定コロニーかイーストは成長(agarose) の版からの生殖不能のつまようじまたはピペットの先端と選ばれる。これはPCR のマスターの組合せにそして挿入されるか、またはオートクレーブに入れられた水に前挿入される。コロニーが興味のDNA の片かプラスミッドを含んでいるかどうか定めるためにPCR はそれから行なわれる。

細菌のE.Coli のコロニーPCR の議定書

コロニーPCR 速いPrep の方法

ステップ1:

オートクレーブに入れられたつまようじまたはピペットの先端の細菌のコロニーを選び、それオートクレーブに入れられたmicrofuge の μ管のTE によってオートクレーブに入れられるdH2.O の25 のl に渦巻きなさい。全体のコロニーを取除かないし、あなたが数を版preferrably 選んだ区域に印を付けなさい(およびmicrofuge の管) の底。

ステップ2:

沸騰水の浴室の組合せまたは2 分のための熱い(90-100C) 暖房のブロックを熱しなさい

ステップ3:

2 分の回転のサンプル高速遠心分離機で。

ステップ4:

移動 μ新しいmicrofuge の管への上澄みの20 のl 。

ステップ5:

25 の μl PCR 標準的なPCR の反作用の型板として μ上澄みの1-2 l を取りなさい。

イーストコロニーPCR の議定書

37C 定温器から育った取得イースト細胞は(新たに育てられたイーストよりよい) 新しい版で

オートクレーブに入れられたつまようじまたはピペットの先端を取り、僅かなイーストコロニーに触れなさい。全コロニーを擦ってはいけない。標準的なPCR のmastermix にそれを中断しなさい。

PCR の循環の状態:

最初変化のステップ: 95 の .C 、5 分

ステップの変化: 95 .C 、30 秒

アニーリングのステップ: 50-55 .C 、30 秒

延長ステップ: 72 .C 、1min/kb

ステップ s2-4 を繰り返しなさい: 34 回

最終的な延長: 72 の.C 、3 分

1% のagarose のゲルに全体のPCR の反作用に荷を積みなさい。