反対PCR
反対PCRの背景
反対PCRはまたIPCRを呼出し、Ochmanによって1988年(1)で最初に等記述されていた。
標準PCRの限定は興味のDNAのフラグメントの5つ'そして3つの'並ぶ領域が知られていなければならないことである。 反対PCRは1つの内部シーケンスの情報だけを有するときPCRを行なうことを可能にする。
反対のポリメラーゼの連鎖反応はターゲットDNAの1つの内部シーケンスだけ知られているときPCRの変形、使用される。 従ってそれはgenomic挿入の並ぶDNAシーケンスの識別に非常に有用である。 他のPCR方法に類似した、反対PCRはDNAポリメラーゼを使用してターゲットDNAを増幅する。
反対PCRは通常のオリエンテーションの逆方向でプライマーを方向づけてもらうどんなに、標準PCR (ポリメラーゼの連鎖反応)を使用する。 逆のプライマーのためのテンプレートは円を形作るためにそれ自身に縛られた制限のフラグメントである。
反対PCR方法
反対PCR方法は制限のendonucleaseで切られるDNAとの一連の消化力そして自己ligationsが含まれている。 この切口は未知のシーケンスのどちらかの終わりに知られていたシーケンスで起因する。
反対PCRは歩む
1)ターゲットDNAは制限のendonucleaseの消化力で複数のkilobasesのより小さいフラグメントに軽く切られる。
2)自己ligationは改良する隣酸塩バックボーンは低い集中によりの下で誘導される。 これは円DNAのligationの製品を与える。
3)ターゲットDNAはそれから知られていたendonucleaseと消化される制限である。 これは知られていたターミナルシーケンスの線形製品を生成する知られていた内部シーケンス内の切口を生成する。 これはPCR (ポリメラーゼの連鎖反応)に今使用することができる。
4)標準PCRは今によって知られている内部シーケンスに補足プライマーによって行なわれる。
要約すると:
反対PCRは知られていたシーケンスを並べるシーケンスをクローンとして作るために作用する。 並ぶDNAシーケンスは円DNAを生成するために消化され、次に縛られる。
知られていたシーケンスから指すPCRのプライマーはそれから並ぶシーケンスを増幅するために用いられる。
反対PCRのアプリケーション
反対PCRにtransposable要素を並べるシーケンスの拡大そして識別を含む分子生物学で多数のアプリケーションおよびgenomic挿入の識別がある。
反対PCRのプロトコル
反対PCRの参照
1. Ochman H、Gerberように、Hartl DL。 遺伝学。 11月1988日; 120 (3): 621-3。