PCRのクローニング
クローニングPCRの製品
プラスミッドか構造物にDNAのフラグメントをクローンとして作りたいと思えばこれをする簡単な方法の1つはPCRを使用している。 プラスミッドでDNAのフラグメントか遺伝子が既にあり、フラグメントを並べる制限のサイトがあなたがそれをにクローンとして作りたいと思う新しいプラスミッドと互換性があれば制限の酵素の消化力は通常よく働く。
ただし、フラグメントのための新しい制限のサイトを設計するか、削除をフラグメントの組み立てるか、またはDNA内のサイトを変異させたいと思えばDNAのフラグメントのPCRまたはポリメラーゼの連鎖反応はPCRを使用してフラグメントをクローンとして作る最も容易で、最もよい方法の1つである。
PCRのクローニングのためのプライマーの設計
PCRのクローニングのためのプライマーは通常制限のサイトを追加する必要性のためにより長い。
制限のサイトは通常長さが6 bpである。 subcloneにPCRの製品行かなければ、制限のサイトのヌクレオチド5を'追加する必要がある
これは制限の酵素がに結合し、より効率的であるために制限のサイトを切るようにする。
スペーサの制限のサイトのプライマーシーケンス(プライマープログラムによって設計されている)
3 bp --6bp 15-22 bp
PCR Subcloning
(Subcloneは興味のベクトルにそれを挿入する前にベクトルにPCRの製品をクローンとして作ることを意味する。 これの利点は決してPCR挿入再度ならないという事実を、常に持って冷却装置のそれを含み、多くを育つことができほしいと細菌を使用する。)
私達の経験から、PCRの製品を切ることは通常ベクトルから切断のフラグメントより大いにより少なく効率的である。 従って、PCRの製品を切り、効率的およびあなたが問題をこれをすることを持つかもしれないベクトルにクローンとして作ることは直接そうかもしれない。
それは通常subcloningベクトルにsubcloning方法最もよいである。
TOPOのベクトル
TOPOのベクトルは高くていいが、subcloningのために大きい。 それらは時間結局は保存し、クローニングPCRの製品をより容易およびより効率的にさせる。
これの理由は容易にプラスミッドのDNAを消化できることである。 それは容易にに結合し、部分を消化できるので制限の酵素のためにより効率的である。
不利な点は効率的な、最適化されたPCRの状態を持たなければならないことである。 PCRの多くのバンドの存在は興味のPCRの製品をクローンとして作ること不可能それを困難にさせる。
2日以内程でsubclone PCRの製品通常できる。 Ligationは5分だけかかり、細菌のコロニーをligationのめっきできる日。 コロニーを翌日選び、媒体の育てれば、またただ挿入、増幅するために今あなたが幾年もの間液体窒素にグリセロールとフリーズできるsubcloned挿入の細菌のコロニーを有する。
これは実際に挿入が付いている別の構造物を作る必要があるとき助ける!