PCR のクローニング
クローニングPCR プロダクト
プラスミッドか構造物にDNA の片をクローンとして作りたいと思えばこれをする最も容易な方法の1 つはPCR を使用している。プラスミッドでDNA の片か遺伝子が既にあり、片を並べる制限の場所があなたがそれをにクローンとして作りたいと思う新しいプラスミッドと互換性があれば制限の酵素の消化力は通常よく働く。
但し、片のための新しい制限の場所を設計するか、削除を片の組み立てるか、またはDNA 内の場所をmutate たいと思えばDNA の片のPCR またはポリメラーゼの連鎖反応はPCR を使用してあなたの片をクローンとして作る最も容易で、最もよい方法の1 つである。
PCR のクローニングのためのプライマーの設計
PCR のクローニングのためのプライマーは制限の場所を加える必要性のために通常より長い。
制限の場所は長さの6 bp 通常である。subclone にPCR プロダクト行かなければ、制限の場所のヌクレオチド5' を加える必要がある
これは制限の酵素がに結合し、より有効であるために制限の場所を切るようにする。
(プライマープログラムによって設計されている) スペーサの制限の場所のプライマー順序
3 bp -- 6bp -- 15-22 bp
PCR Subcloning
(Subclone は興味のあなたのベクトルにそれを挿入する前にベクトルにPCR プロダクトをクローンとして作ることを意味する。これの利点は常に決してPCR あなたの挿入物再度ならないという事実を、持って冷却装置のそれを含み、多くを育てることができほしいと細菌を。使用する)
私達の経験から、PCR はプロダクトを切るベクトルから切断の片より通常大いにより少なく有効である。従って、切断PCR プロダクトおよび有効及びあなたが悩みをこれをすることを持つかもしれないあなたのベクトルにそれらをクローンとして作ることは直接そうかもしれない。
それはsubcloning ベクトルにsubcloning 方法通常最もよいである。
TOPO のベクトル
TOPO のベクトルは高い場合もあるが、subcloning のために大きい。それらは時間結局は救い、クローニングPCR プロダクトを容易く及び有効くさせる。
これの理由は容易にプラスミッドのDNA を消化できることである。それは容易にに結合し、あなたの部分を消化できるので制限の酵素のためにより有効である。
不利な点は有効な、最大限に活用されたPCR の状態を持たなければならないことである。あなたのPCR の多くのバンドの存在は興味のあなたのPCR プロダクトをクローンとして作ること不可能それを困難にさせる。
2 日以内程でsubclone あなたのPCR プロダクト通常できる。Ligation は5 分しか取り、あなたの細菌のコロニーをligation のめっきできる日。コロニーを翌日選び、媒体の育てれば、またただあなたの挿入物、増幅するために今あなたのの細菌のコロニーをsubcloned あなたが幾年もの間液体窒素にグリセロールと凍らせることができる挿入物を有する。
これは実際にあなたの挿入物が付いている別の構造物を作る必要があるとき助ける!