PCRの酵素: PCRのポリメラーゼ
PCRのポリメラーゼ-最終的なガイド
版権2006年のPCR端末
PCRのポリメラーゼ: 導入
PCRによって用いられる実験の目的によってDNAポリメラーゼの選択は定められる。 今では熱安定性、processivityおよび忠誠でそのから選択するべき商用化された酵素の茄多が異なるある。 最も広く使われた、最も広く最も調査された酵素はTaq DNAポリメラーゼである。
最初のPCRのポリメラーゼ
最初のPCRの反作用で最初に使用されたDNAポリメラーゼは細菌エシェリヒア属大腸菌から得られた。 この酵素があったが多くののための非常に貴重なツールは分子生物学の研究以前使用し、今日、元のPCRで多くの不利な点を有した。 PCRでは、pcrの反作用は各サイクルの後でdouble-stranded DNAの製品を熱することによって変化しなければならない。 残念ながら、また熱して不可逆的にエシェリヒア属大腸菌DNAポリメラーゼを非アクティブにした。 酵素の新しい因数は各サイクルのはじめに手動で追加されなければならなかった。 PCRの30-40のサイクルによって、これは非常に困難で、退屈なタスクだった。
必要となったものが90°Cで行われたDNAの変性のステップの間に安定している残されてことDNAポリメラーゼまたは震える。 発見は解決を大いにもっと簡單にした。 細菌のThermophilus aquaticusは水温泉から隔離された。 この細菌は温泉の非常に最高温度でできた存続し、増殖する。 この細菌からのDNAポリメラーゼの隔離は高温で急速に非アクティブにならなかったPCRのポリメラーゼをもたらした。 Cetus株式会社のGelfandは等正常にPCRのポリメラーゼの今呼出されたTaqこの(不足分のThermophilus aquaticus)のポリメラーゼを浄化し、クローンとして作った。
これはPCRの反作用の管を開き、新しいポリメラーゼを追加する必要性なしで行われるべきPCRの拡大の30-40のサイクルを割り当てた。 もたらすことができるこのまた減らされた潜在的な汚染は元のPCRの反作用でポリメラーゼを20-30に手動で追加するとき時間を計る。 また、好熱性の細菌およびポリメラーゼ、Taqの性質が原因で72°Cのまわりで温度で最上に作用し、大いにより高くで行われるようにDNAの統合がする
エシェリヒア属大腸菌の酵素と可能だったより温度。 これはテンプレートDNAの繊維がPCRのプライマーアニーリングのより高いstrigencyによる大いにハイファイでコピーされるようにする利点を有した。 この多くのより早いPCRの反作用に影響を与えたそれ以上の減らされた無指定の製品。
TAQ DNAポリメラーゼ
またTaqのポリメラーゼ単に名づけられた「Taq」は、PCRのサイクルのDNAの複製の反作用に触媒作用を及ぼすのにポリメラーゼの連鎖反応(PCR)で使用されるthermostable DNAポリメラーゼである。 こうすれば拡大の、PCRは生物的サンプルの興味の遺伝子の存在か不在のために検査できる。
Taq DNAポリメラーゼの分子モデル。 TaqのDNAポリメラーゼの結晶構造は構造特定のヌクレアーゼの領域のための新しいオリエンテーションを示す。
Taq DNAポリメラーゼはthermostable特性によるPCRのエシェリヒア属大腸菌DNAポリメラーゼを取り替えた。 TaqはThermusのaquaticus、温泉および熱水出口に住んでいる細菌から最初に隔離された。
Taqは変化に抗調節する最初のポリメラーゼだった(PCRの循環の間に必要な90 °C)に。
Taqに約40 min.の95°Cでeのnzymatic半減期がある。 Taqのより多くの特性のために、次表を見なさい。
Taqのポリメラーゼの主要な不利な点の1つは低い複製の忠誠である。 最近総合されたDNAの繊維の偶然の不適当な組み合わせを取り替えるためにTaqに' 5 'に3 exonucleaseがメカニズムを校正することをないのでTaqは作り出しPfuのようなポリメラーゼを校正するよりより多くのエラーを。
Taq DNAポリメラーゼはまたA (アデニン)の突出部分のPCRの製品を作り出すこと一義的である。 かなり有用であるとこれが見つけられTAのクローニングおよびTOPOのクローニング(Invitrogen)を作り出すのに開発された。 これらの方法はT (Thymine)の突出部分を所有しているプラスミッド)またはクローニングベクトルを用いる(。 これはすぐにPCRの製品のAの突出部分と達成されるべきtopoisomeraseかDNAのリガーゼを使用してligationを可能にする
PFU DNAポリメラーゼ
Pfu DNAポリメラーゼは有機体のDNAを複製するために生体内で作用するarchaeonのPyrococcusのhyperthermophilic furiosusで見つけられる酵素である。 生体外で、Pfuがすぐに酵素が各拡張ステップの間にDNAの新しい繊維のコピーの中心的役割に役立つポリメラーゼの連鎖反応のDNAを増幅するのに使用されている。
Pfuのポリメラーゼの優越性はPfuと代わりとなる酵素間の主な違いPfuの優秀な耐熱性および他のthermostableポリメラーゼと比較される特性を「校正すること」である。 Taq DNAポリメラーゼとは違って、Pfu DNAポリメラーゼは」5」に3」5への終わり」端からのDNAに沿う方法を働かせ、ヌクレオチドmisincorporationのエラーを訂正することを意味する作業を校正する3 exonucleaseを所有している。 これはPfu DNAによってポリメラーゼ生成されたPCRのフラグメントにTaq生成されたPCRの挿入より少数のエラーがあることを意味する。 その結果、Pfuは歴史的に普及したTaqよりPCRのフラグメントの分子クローニングのために一般には使用される。 商用化されたPfuは1.3百万の基礎ペアに付き1つの誤り率で普通1kbフラグメントをPCRを使用して増幅するとき起因し、2.6%の変異する製品をもたらすことができる。 ただし、Pfuはより遅く、72° C.でDNAの1kbを増幅するように普通1-2分を要求する。 Pfuを使用してPCRの反作用のDNAポリメラーゼはまた鈍終了されたPCRの製品で起因する。 Pfu DNAポリメラーゼはそれ故にハイファイDNAの統合を必要とする、またTaqのポリメラーゼと共にTaqのポリメラーゼの作業の速度のPfuの忠誠を得るのに使用することができる技術のための目上の人。
歴史
科学者はLa Jollaで基づいてバイオテクノロジーの会社Stratageneとカリフォルニア検出した1991年にTaq上のPfuの優越性を関連付けた。 彼らはその年(遺伝子の12月のジャーナル遺伝子の彼らの作業を出版した。 12月1991日12日; 108 (1): 1-6)。 米国Pfu自体上の米国のパテント5,545,552が1996年8月に許可される間、パテント5,489,523は2月1996日のexonuclease不十分なPfuに許可された。
PCRのポリメラーゼ
使用できるPCRのポリメラーゼおよび特性の概要。
DNAポリメラーゼ |
生物的ソース |
5 '--3 ' Exonuclease 作業 |
3 '--5 ' Exonuclease 作業 |
95°C半減期(分) |
商業名前 |
供給の会社 |
拡張率(nucleosides/s) |
誤り率 |
1kb (72°C)への時間(s) |
Taq |
Thermus Aquaticus |
+ |
- |
40 |
AmpliTaqのAmpliTaqの金 |
Promega、Roche、Invitrogenおよび多くの他。 |
75 |
10^3の1 |
32 |
Pfu |
Pyrococcusのfuriosus |
- |
+ |
120 |
PfuTurbo |
Stratagene、Fermentas、他の中のInvitrogen
|
60 |
1.3 x 10^6の1 |
60-120 |
Pwo
|
Pyrococcusのwoesei |
- |
+ |
N/A |
N/A |
N/A |
N/A |
||
Tfl |
Thermas flavus |
- |
- |
||||||
rTth |
thermophilus Themus |
+ |
- |
20 |
|||||
Tli |
Thermusのlitoris |
- |
+ |
400 |
出口 |
||||
Tma |
Thermotogaのmaritima |
- |
+ |
>50 |
|||||
PCRおよびポリメラーゼ
PCRはDNAで大きいより10 kilobases平均PCRがDNAの少数の千のベースにだけ数百であるどんなに、行われた。 長いPCRを用いる問題は酵素の正確さとprocessivity間にバランスがあることである。 通常より長いフラグメント、より大きいエラーの確率。
PCRのポリメラーゼの参照
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3。
版権2006年のPCR端末