PCR のトラブルシューテ-ィング
PCR 問題及び解決のPCR の助け
あなたのPCR 問題はか。である何:
PCR の長い無指定プロダクト
agarose のゲルを動かした場合右のサイズでないより大きい無指定のPCR バンドに斑点を付ける。
PCR の長い無指定プロダクトへの解決:
減少アニーリング時間
減少延長時間
62-68 C への減少延長º 温度
1.2x-2x への増加のKCl (緩衝) の集中、しかし1.5-2mM のたくわえのMgCl2 の集中
増加のMgCl2 の集中3-4.5 ミリメートルまでしかしたくわえのdNTP の集中の定数。
より少ないプライマーを使用しなさい
より少ないDNA の型板を取りなさい
Taq のより少ないポリメラーゼを取りなさい
上記の仕事のどれも: プライマーを反復的な順序があるように(送風はデータベースと順序を一直線に並べる) 確認し、primer(s) を変えなさい
上記のsome/all の組合せ。
問題:
PCR のプライマー二量体
agarose のゲルを動かした場合、一部の非常に小さいPCR バンドに斑点を付ける。これらはあなたのプライマーのまたは両方のあなたのプライマーのサイズのサイズである(A 及び一緒のb) 。これらは"プライマー二量体" と名づけられ、それ自身のまたは他のプライマーが付いているあなたのプライマーのアニーリングによって形作られる。
PCR のプライマー二量体への解決:
より少ないプライマーを使用しなさい。
デザイン変更のプライマーは新しいバッチを発注し。プライマーが補足順序の大きいパーセントを共有しないこと自己アニーリングのための使用プライマー設計ソフトウェアそして点検確かめ。注意深の点検のプライマーOligoAnalyzer のhomo 二量体及びhetero 二量体の形成のために
フォルムアミドとのそしてのない行ないPCR 。
Mg2+ (MgCl - 1.5 の、2.0 の、2.5 のそして3.0 ミリメートル) の集中をTitrate 。
DNA の型板量(集中) を増加しなさい。
アニーリングの温度(アニーリングのための発見の最適の温度に勾配PCR 機械を使用して最大限に活用する試み) を増加しなさい。
5% までDMSO を加えることを試みなさい。
Taq の規則的なポリメラーゼPCR の代りにHotStart PCR を使用することを試みなさい。
上記のsome/all の組合せ。