PCRのトラブルシューティング
PCR問題および解決のPCRのヘルプ
PCR問題はである何か。:
問題:
PCRの長い無指定の製品
agaroseのゲルを実行した場合右のサイズではないより大きい無指定PCRバンドに斑点を付ける。
PCRの長い無指定の製品への解決:
減少アニーリング時間
減少拡張時間
62-68º Cへの減少拡張温度
1.2x-2xへの増加のKCl (バッファ)の集中、しかし1.5-2mMのたくわえのMgCl2の集中
増加のMgCl2の集中3-4.5までmMしかしたくわえのdNTPの集中の定数。
より少ないプライマーを使用しなさい
より少ないDNAのテンプレートを取りなさい
Taqのより少ないポリメラーゼを取りなさい
上記に該当なし:働けば: プライマーを反復的なシーケンスがあるように(送風はデータベースとシーケンスを一直線に並べる)確認し、プライマーを変更しなさい
いくつかの組合せまたは上すべて。
問題:
PCRのプライマー二量体
agaroseのゲルを実行した場合、一部の非常に小さいPCRバンドに斑点を付ける。 これらはプライマーのまたは両方のプライマーのサイズのサイズである(Aおよび一緒のB)。 これらは「プライマー二量体」と名づけられ、それ自身のまたは他のプライマーが付いているプライマーのアニーリングによって形作られる。
PCRのプライマー二量体への解決:
より少ないプライマーを使用しなさい。
デザイン変更のプライマーは新しいバッチを発注し。 プライマーが補足シーケンスの大きいパーセントを共有しないこと自己アニーリングのための使用のプライマーデザインソフトウェアそして点検確かめれば。 OligoAnalyzerとヒト属二量体およびhetero二量体の形成があるようにプライマーを注意深く確認しなさい
フォルムアミドの有無にかかわらずPCRを行ないなさい。
Mg2+ (MgCl - 1.5、2.0、2.5そして3.0 mM)の集中を滴定しなさい。
DNAのテンプレート量(集中)を増加しなさい。
アニーリングの温度(アニーリングのための最適の温度を見つけるために勾配PCR機械を使用して最適化する試み)を増加しなさい。
5%までDMSOを追加することを試みなさい。
規則的なTaqのポリメラーゼPCRの代りにHotStart PCRを使用することを試みなさい。
いくつかの組合せまたは上すべて。