RT-PCR
トランスクリプションポリメラーゼの連鎖反応を逆転させなさい
逆のトランスクリプションポリメラーゼの連鎖反応(RT-PCR)はポリメラーゼの連鎖反応(PCR)に基づいている。 もっと重大にそれは逆がDNAにRNAを転写し、retrovirusesから最初に隔離された逆のトランスクリプションのプロセスに基づいている。
RT-PCRの技術はからのcDNA (またはコピーDNAの形成を補足)核酸のより安定した形式でRNAのシーケンスを(メッセンジャーRNA、mRNAのような)保存するRNA、DNA可能にする。 逆の補数DNA (cDNA)へのRNAからのこの逆のトランスクリプションはRT-PCRの通常ツーステッププロセスの第一歩である。 なお、DNAへのRNAのコピーによって、1つは特定のDNAシーケンスのためにプライマーを使用することによってそれからcDNAシーケンスを増幅できる。 この拡大はRT-PCRのツーステッププロセスの最終的な第2主要なステップである。
RT-PCRのプロセス
RT-PCRの第一歩はように「最初繊維の反作用」参照される。 最初繊維の反作用では、補足DNAのまた名づけられたcDNAはoligo dT (3 'ほとんどのmRNAsにある3 ' UTRにあるpolyAシーケンス-未翻訳領域にプライマーおよび縛りと同じようなオリゴヌクレオチドの多dTs行為)を使用して興味のメッセンジャーRNAのテンプレートから、dNTPs作られ、RNA依存したDNAポリメラーゼは逆のトランスクリプションのプロセスによって、transcriptaseを、逆転させる。
これらの要因は37°C.の1時間逆のtranscriptaseバッファで結合される。 逆のtranscriptaseの反作用が完全であり、cDNAが総合された後、RNAcDNAのハイブリッドからのRNAを消化するRNaseHは追加される(RNAの消化力の酵素)。 RNaseHの孵化の後で、標準PCRかポリメラーゼの連鎖反応は興味のシーケンスのために特定のDNAのoligoプライマーを使用して行なわれる。 この第2ステップはように「第2繊維の反作用」参照される。
従ってthermostable DNAポリメラーゼの、上下流DNAのプライマーは追加によって、単一の残されたDNA残される倍になり、補足DNAの増幅によって増幅され、まれか低いコピーmRNAシーケンスの検出を許可する。
RT-PCRのアプリケーション
mRNAの補足シーケンスの指数拡大か逆のトランスクリプションポリメラーゼの連鎖反応によるRNAシーケンスは低い限定番号かより少なく豊富なRNAの分子が検出することができる高い感度の検出の技術を可能にする。 また補足DNAの形でmRNAシーケンスをクローンとして作ることを使用し作成されるようにセルに表現される遺伝子のすべてのmRNAシーケンスを含んでいるcDNA (cDNAライブラリ)のライブラリがする。 なお、それはRT-PCRによってクローンとして作られ、それ以上の調査のためのRNAおよび蛋白質のレベルで遺伝子の表現を可能にするcDNAの構造物の作成を可能にする。