PCR 클로닝
클로닝 PCR 제품
플라스미드 또는 구조물로 DNA의 파편을 복제하고 싶은 경우에, 이것을 하는 쉬운 방법의 한개는 PCR를 사용하고 있다. 플라스미드에서 DNA 파편 또는 유전자가 이미 있고, 파편을 측면에 서는 금지 사이트가 당신이 그것을로 복제하고 싶은 새로운 플라스미드와 호환이 되는 경우에, 금지 효소 소화는 일반적으로 잘 작동한다.
그러나, 파편을 위한 새로운 금지 사이트를 설계하거나, 삭제를 파편의 구성하거나, DNA 내의 사이트를 변화시키고 싶은 경우에, DNA 파편의 PCR 또는 폴리메라이제 연쇄 반응은 PCR를 사용하여 파편을 복제하는 가장 쉬운 최고 방법의 한개 이다.
PCR 클로닝을 위한 뇌관 디자인
PCR 클로닝을 위한 뇌관은 일반적으로 금지 사이트를 추가하는 필요 때문에 더 길다.
금지 사이트는 일반적으로 길이의 6 bp이다. subclone에 PCR 제품 가지 않는 경우에, 금지 사이트의 뉴클레오티드 5를 ' 추가할 필요가 있다
이것은 금지 효소가에 묶고 능률적이기 위하여 금지 사이트를 자르는 것을 허용한다.
(뇌관 프로그램에 의해 디자인되는) 간격 장치 금지 사이트 뇌관 순서
3 bp --6bp 15-22 bp
PCR Subcloning
(Subclone는 관심사의 선그림으로 그것을 삽입하기 전에 선그림으로 PCR 제품을 복제하는 것을 의미한다. 이것의 이점에는 PCR 삽입 결코 다시 하지 않는다 는 사실을, 항상 있어 냉장고에서 그것이 포함하고, 자랄 수 있어 원한다 만큼 박테리아를 사용한.)
우리의 경험에서, PCR 제품을 자르는 것은 일반적으로 선그림에서 절단 파편 보다는 매우 보다 적게 능률적이다. 따라서, PCR 제품을 자르고 능률과 당신이 말썽을 이것을 하는 가지고 있을 수 있는 선그림으로 복제하는 것은 직접 있지 않을지도 모른다.
그것은 일반적으로 subcloning 선그림으로 subcloning 방법 이다 최상이다.
TOPO 선그림
TOPO 선그림은 비싸서도 좋더라도, subcloning를 위해 중대하다. 그(것)들에 의하여 시간 결국에는 저장하고, 클로닝 PCR 제품이 더 쉬운과 능률에게 한다.
이것을 위한 이유는 쉽게 플라스미드에 있는 DNA를 소화할 수 있다 이다. 그것은 쉽게에 묶고 피스를 소화하기 수 있기 때문에 금지 효소를 위해 능률적이다.
불리는 능률 적이고 및 낙관한 PCR 상태가 있어야 한다 이다. PCR에 있는 많은 악대의 존재는 만일 관심사의 PCR 제품을 복제하게 불가능할 것이 그것을 어려울 것이 만들 것이다.
subclone 대략 2 일 안에 PCR 제품 일반적으로 할 수 있다. 결찰은 단지 5 분이 걸리고 세균성 식민지를 결찰의 도금할 수 있다 일. 일단 식민지를 다음날에 선택하고 매체에서 증가하면, 또한 지금 뿐만 아니라 삽입, 있다 당신이 수년간 액체 질소로 글리세롤로 얼 수 있는 subcloned 삽입의 세균성 식민지가 증폭한다.
이것은 실제적으로 삽입을 가진 다른 구조물을 만들 필요가 있을 때 돕는다!