PCR 효소: PCR 폴리메라이제

PCR 폴리메라이제 - 궁극적인 가이드

저작권 2006년 PCR 역

PCR 폴리메라이제: 소개

PCR에 의해 채택된 실험의 목표에 의해 DNA 폴리메라이제의 선택은 결정된다. 지금 그들의 열 안정성, processivity 및 절조에서 그에서 선택할 것이다 상업적으로 이용 가능한 효소의 다혈증이 다르다 있다. 통용되고는 가장 광대하게 공부한 효소는 Taq DNA 폴리메라이제이다.

처음 PCR 폴리메라이제

첫번째 PCR 반응에서 원래 이용된 DNA 폴리메라이제는 박테리아 대장균에게서 추출되었다. 이 효소가 이었더라도 많은을 위한 값을 헤아릴 수 없는 공구는 분자 생물학 연구 과거에는 사용하고 오늘 조차, 본래 PCR에 있는 많은 불리가 있었다. PCR에서는, pcr 반응은 각 주기 후에 double-stranded DNA 제품을 가열해서 변성되어야 한다. 불행히도, 또한 가열해서 돌이킬 수 없 대장균 DNA 폴리메라이제를 활동하지 않았다. 효소의 신선한 약수는 각 주기의 시작에 수동으로 추가되어야 했다. PCR의 30-40 주기로, 이것은 아주 힘들고 무료한 업무이었다.

요구된 무슨이 90°C에 실행된 DNA 변성 단계 도중 안정되어 있 남아 있어 DNA 폴리메라이제이고 또는 뜨겁게 한다. 발견은 해결책을 매우 쉽게 했다. 박테리아 Thermophilus aquaticus는 물 온천에서 고립되었다. 이 박테리아는 온천의 극단적으로 만조 온도에서 능력 있었다 살아나고 증식한다. 고열에 급속하게 활동되지 않지 않은 PCR 폴리메라이제가 이 박테리아에게서 DNA 폴리메라이제의 격리에 의하여 열매를 산출했다. Cetus 기업에 Gelfand는 그 외 여러분 성공적으로 PCR 폴리메라이제 지금 불린 Taq 이 (간결에 있는 Thermophilus aquaticus) 폴리메라이제를 순화하고 복제했다.

이것은 PCR 반응 관을 열고 신선한 폴리메라이제를 추가하는 필요 없이 실행될 PCR 확대의 30-40 주기를 허용했다. 소개될 수 있던 이 또한 감소된 잠재적인 오염은 본래 PCR 반응에서 폴리메라이제를 20-30 이상 수동으로 추가할 때 시기를 정한다. 더구나, thermophilic 박테리아 및 폴리메라이제, Taq의 본질 때문에 72°C의 주위에 온도에 최적으로 작용해, 매우 높이에 실행되는 것을 DNA 종합이 허용한
대장균 효소에 가능한 것 보다 온도. 이것에는 템플렛 DNA 물가 PCR 뇌관 어닐링의 더 높은 strigency 때문에 매우 고충실도에 베껴지는 허용의 이점이 있었다. 이 많은 초기 PCR 반응에 영향을 미쳤었던 추가 감소된 일반적인 제품.

TAQ DNA 폴리메라이제

또한 Taq 폴리메라이제 단순히 불린 "Taq"는, PCR 주기에 있는 DNA 복제 반응을 촉매 작용을 미치기 위하여 폴리메라이제 연쇄 반응 (PCR)에서 이용된 thermostable DNA 폴리메라이제 이다. 이런 방식으로 확대의, PCR는 생물학 견본에 있는 관심사의 유전자 존재 또는 결핍을 위해 검토할 수 있다.

Taq DNA 폴리메라이제

Taq DNA 폴리메라이제의 분자 모형. Taq DNA 폴리메라이제의 결정 구조는 구조 특정 Nuclease 도메인을 위한 새로운 오리엔테이션을 보여준다.

Taq DNA 폴리메라이제는 그것의 thermostable 속성 때문에 PCR에 있는 대장균 DNA 폴리메라이제를 대체했다. Taq는 Thermus aquaticus, 온천 및 열수 환풍에서 사는 박테리아에서 처음으로 고립되었다.

Taq는 변성시키기 저항할 수 있던 조절하는 첫번째 폴리메라이제이었다 (PCR 순환 도중 요구되는 90 °C) 이상.

Taq에는 대략 40 min.의 95°C에 e nzymatic 반감기가 있다. Taq의 추가 속성을 위해, 아래에 테이블을 보십시오.

Taq 폴리메라이제의 중요한 불리의 한개는 그것의 낮은 복제 절조이다. 새로 종합하기 DNA 물가에 있는 우연한 미스매치를 대체하기 위하여 Taq에는 ' 5 '에 3 exonuclease가 기계장치를 교정하기 없기 때문에, Taq는 일으켜 Pfu와 같은 폴리메라이제 교정 보다는 추가 과실을.

Taq DNA 폴리메라이제는 또한 A (아데닌) 오버행에 PCR 제품이 에 의하여 생성한다 유일하다 에서. 이것은 확실히 유용하기 위하여 찾아내고, TA 클로닝과 TOPO 클로닝 (Invitrogen)를 일으키기 위하여 개발되었다. 이 방법은 T (Thymine) 오버행을 소유하는 플라스미드) 또는 클로닝 선그림 를 채택한다 (. 이것은 빨리 PCR 제품의 A 오버행에 달성될 것이다 topoisomerase 또는 DNA 리가제를 사용하여 결찰을 허용한다

PFU DNA 폴리메라이제

Pfu DNA 폴리메라이제는 유기체의 DNA를 복제하기 위하여 VIVO에서 작용하는 archaeon Pyrococcus hyperthermophilic furiosus에서 찾아낸 효소이다. 생체외에서, Pfu는 빨리 DNA의 새로운 물가를 베끼기의 주요 기능이 각 연장 단계 도중 효소에 의하여 봉사하는 폴리메라이제 연쇄 반응에 있는 DNA를 증폭하기 위하여 이용된다.

Pfu 폴리메라이제의 우월은 Pfu와 양자택일 효소의 주요 차이 Pfu의 우량한 thermostability 및 다른 thermostable 폴리메라이제와 비교된 속성을 "교정하는"이다. Taq DNA 폴리메라이제와는 다른, Pfu DNA 폴리메라이제는 ' 5 '에 3 ' 5에 끝 ' 끝에서 DNA에 따라서 그것의 방법을 작동하고 뉴클레오티드 misincorporation 과실을 정정한ㄴ다는 것을 의미하는 활동을 교정하는 3 exonuclease를 소유한다. 이것은 Pfu DNA에 의하여 폴리메라이제 생성된 PCR 파편에는 Taq 생성한 PCR 삽입 보다는 몇몇 과실이 있을 것이라는 점을 의미한다. 그 결과로, Pfu는 역사적으로 대중적인 Taq 보다는 PCR 파편의 분자 클로닝을 위해 더 일반적으로 사용된다. 상업적으로 이용 가능한 Pfu는 1.3 백만개의 기본적인 쌍에 대하여 1의 오류율 전형적으로 1kb 파편을 PCR를 사용하여 증폭할 때 귀착되고 2.6% 변화된 제품을 열매를 산출할 수 있다. 그러나, Pfu는 더 느리 72° C.에 DNA의 1kb를 증폭할 것을 전형적으로 1-2 분이 요구한다. Pfu를 사용하여 PCR 반응에 있는 DNA 폴리메라이제는 또한 무뚝뚝하 끝난 PCR 제품 귀착된다. Pfu DNA 폴리메라이제는 그러므로 고충실도 DNA 종합을 요구하는 기술을 위한 상사이고, 그러나 또한 Taq 폴리메라이제 함께 Taq 폴리메라이제 활동의 속도를 가진 Pfu의 절조를 얻기 위하여 사용될 수 있다.

역사

과학자는 라호야에서 근거한 biotech 회사 Stratagene와, 캘리포니아 발견했다 1991년에 Taq에 Pfu의 우월을 관련시켰다. 그(것)들은 그 년 (유전자의 12월에 있는 전표 유전자에 있는 그들의 일을 간행했다. 12월 1991일 12일; 108 (1): 1-6). 미국 Pfu 자체에 미국 특허 5,545,552가 1996년 8월에서 수여되는 동안 특허 5,489,523는 2월 1996일에 있는 exonuclease 불충분한 Pfu에 수여되었다.

PCR 폴리메라이제

유효한 PCR 폴리메라이제 및 그들의 속성의 개요.

DNA 폴리메라이제	생물학 근원	5 '--3 ' Exonuclease 활동	3 '--5 ' Exonuclease 활동	95°C 반감기 (분)	상업 이름	공급 회사	연장 비율 (nucleosides/s)	오류율	1kb (72°C)에 시간 (s)
Taq	Thermus Aquaticus	+	-	40	AmpliTaq 의 AmpliTaq 금	Promega, Roche, Invitrogen 및 많은 그 외.	75	10^3에서 1	32
Pfu	Pyrococcus furiosus	-	+	120	PfuTurbo	Stratagene, Fermentas, 그 외의 사이에서 Invitrogen	60	1.3 x 10^6에서 1	60-120
Pwo	Pyrococcus woesei	-	+	N/A			N/A	N/A	N/A
Tfl	Thermas flavus	-	-
rTth	thermophilus Themus	+	-	20
Tli	Thermus litoris	-	+	400	환풍
Tma	Thermotoga maritima	-	+	>50

PCR와 폴리메라이제

PCR는 DNA에 더 큰 10 kilobases 평균 PCR가 DNA의 몇천개의 기초에서만 수백 이다 그러나, 실행되었다. 긴 PCR에 대한 문제는 효소의 정확도와 processivity 사이 균형이 있다 이다. 더 긴 파편, 보통, 더 중대한 오차의 확률.

PCR의 유형

PCR 자원