Pcr in situ
Definitie van PCR In situ
Pcr in situ (ISH) is een polymerasekettingreactie die eigenlijk binnen de cel op een dia plaatsvindt. Pcr versterking de in situ kan op vaste weefsel of cellen worden uitgevoerd.
Pcr Inleiding in situ
Tijdens de initiatie en de vooruitgang van ziekte, kunnen de minieme hoeveelheden van een product in kleine bevolkingsaantallen van cellen of de weefsels voor de pathogenese van de ziekte essentieel zijn.
In vele langzaam-evolueert ziekten die maanden of zelfs jaren vereisen om klinisch tot uiting te komen, heeft men getoond dat de meerderheid van de beïnvloede celbevolking in een transcriptionally inactieve staat, en op een niveau van één gen per gastheercel is.
De methodes van nucleic zuurkruising en de polymerasekettingreactie (PCR) zijn allebei aangewend om de uitdrukking en de opsporing van dergelijke beïnvloede genen tijdens pathogenese te onderzoeken. Terwijl beide technieken vrij nuttig zijn, is het nadeel van deze technieken dat zij van de celuitdrukking en bevolking hoofdzakelijk studies uitvoeren. Nucleic zuren zijn geïsoleerd van een bevolking van cellen die of een voldoende aantal molecules om direct door standaardkruisingstechnieken bevat te ontdekken, of, wanneer een sub-bevolking zo weinig zoals één enkel exemplaar van nucleic zuur bevat, die molecule vergroot door PCR, en die na versterking wordt ontdekt.
De kruising in situ (ISH) past de methodologie van de techniek van nucleic zuurkruising op het cellulaire niveau toe. Het combineren van cytochemistry en immunocytochemistry, In situ PCR laat de identificatie van cellulaire tellers toe om worden geïdentificeerd, en laat verder de localisatie van aan cel-specifieke opeenvolgingen toe binnen celbevolking, zoals weefsels en bloedsteekproeven.
Pcr in situ is beperkt tot de opsporing van niet genomic materiaal zoals RNA, genen of genomen, aangezien de opsporingsgrens in de meeste voorwaarden verscheidene exemplaren van het doel nucleic zuur per cel is. Daarom wegens exemplaar is de aantalbeperkingen, kruising van RNA gevoeliger dan de opsporing van DNA.
De factoren die PCR gevoeligheid beïnvloeden In situ omvatten:
1) strandedness van de doelmolecule
2) het gebrek aan een bijkomende opeenvolging proximaal aan de doelopeenvolgingen
Is de omgekeerde transcriptase-gekatalyseerde transcriptie in situ zelfs gebruikt om RNAs te ontdekken die bij vrij hoog exemplaaraantal voorkomen.
Pcr in situ (ISH) Protcol
Aanvankelijk maakt de stoichiometrie van de nucleic zuurcomponenten de reactie inleiding-gedreven. Aangezien de reactie nochtans te werk gaat, begint het PCR product zelf als doel voor verdere versterking, evenals inleiding voor verdere verlenging te functioneren. Het is de accumulatie van opeenvolgingen die in veelvoudige reacties worden verlengd die door de vaste cel wordt behouden en als doel voor de radiolabeled sonde in de opsporingsfase handelt.
De complexe fysieke aard binnen een vaste cel belemmert zowel de efficiency van de polymerase evenals verspreiding als het ontharden, en zo zijn de verlengingstijden veel langer dan die geleid in de waterige (standaardpcr) omstandigheden. Het optimale signaal is producted gewoonlijk het gebruiken van een minieme verlenging 15.