Omgekeerde PCR
Omgekeerde PCR Achtergrond
Omgekeerde PCR riep ook IPCR, en werd eerst beschreven door Ochman et al. in 1988 (1).
Een beperking van standaardPCR is dat 5 ' en 3 ' flankerende gebieden van uw fragment van DNA van belang moeten worden gekend. Omgekeerde PCR staat u toe om PCR te leiden wanneer u slechts de informatie van één interne opeenvolging hebt.
De omgekeerde polymerasekettingreactie is een variant van PCR, en gebruikt wanneer slechts één interne opeenvolging van doelDNA wordt gekend. Het is daarom zeer nuttig in het identificeren van het flankeren de opeenvolgingen van DNA van genomic tussenvoegsels. Gelijkaardig aan andere PCR methodes, omgekeerde vergroot PCR doelDNA gebruikend de polymerase van DNA.
Omgekeerde PCR gebruikt standaardPCR (polymerasekettingreactie), nochtans heeft het de inleidingen die in de omgekeerde richting van de gebruikelijke richtlijn worden georiënteerd. Het malplaatje voor de omgekeerde inleidingen is een beperkingsfragment dat op zich is afgebonden om een cirkel te vormen.
De omgekeerde PCR Methode
De omgekeerde PCR methode omvat een reeks spijsvertering en zelf-afbindingen met DNA die door beperkingsendonuclease wordt gesneden. Deze besnoeiing resulteert in een bekende opeenvolging op één van beide eind van onbekende opeenvolgingen.
Omgekeerde PCR Stappen
1) DNA van het Doel wordt licht gesneden in kleinere fragmenten van verscheidene kilobases door beperkingsendonuclease spijsvertering.
2) de zelf-Afbinding wordt veroorzaakt onder lage concentraties veroorzakend de fosfaatbackbone om te hervormen. Dit geeft een cirkel de afbindingsproduct van DNA.
3) DNA van het Doel is dan beperking die met bekende endonuclease wordt verteerd. Dit produceert een besnoeiing binnen de bekende interne opeenvolging die een lineair product met bekende eindopeenvolgingen produceert. Dit kan nu voor PCR (polymerasekettingreactie) worden gebruikt.
4) StandaardPCR wordt geleid met inleidingen bijkomend aan de nu bekende interne opeenvolgingen.
Samengevat:
Omgekeerde PCR functies aan kloonopeenvolgingen die een bekende opeenvolging flankeren. Het flankeren de opeenvolgingen van DNA worden verteerd en dan afgebonden om cirkelDNA te produceren.
PCR de inleidingen die vanaf de bekende opeenvolgingen richten zijn dan aangewend om de het flankeren opeenvolgingen te vergroten.
Toepassingen van Omgekeerde PCR
Omgekeerde PCR heeft talrijke toepassingen in moleculaire biologie met inbegrip van de versterking en de identificatie van opeenvolgingen flankerend transposable elementen, en de identificatie van genomic tussenvoegsels.
Omgekeerd PCR Protocol
Omgekeerde PCR Verwijzingen
1. Ochman H, Gerber ALS, Hartl DL. Genetica. 1988 Nov.; 120 (3): 621-3.