Pcr het Klonen
Het klonen PCR Producten
Als u een fragment van DNA in een plasmide of een concept wilt klonen, gebruikt één van de gemakkelijkste manieren om dit te doen PCR. Als u het fragment of het gen van DNA reeds in een plasmide hebt, en de beperkingsplaatsen die het fragment flankeren met de nieuwe plasmide compatibel zijn wilt u klonen het in, goed gewoonlijk werkt de spijsvertering van het beperkingsenzym.
Nochtans, als u nieuwe beperkingsplaatsen voor het fragment wilt bouwen, schrappingen van het fragment, construeert of plaatsen binnen DNA verandert, zijn PCR of de polymerasekettingreactie van het fragment van DNA één van de gemakkelijkste en beste manieren om uw fragment te klonen dat PCR gebruikt.
Het ontwerpen van Inleidingen voor PCR het Klonen
De inleidingen voor PCR het klonen zijn gewoonlijk langer wegens de behoefte om beperkingsplaatsen toe te voegen.
De plaatsen van de beperking zijn gewoonlijk 6 bp in lengte. Als u niet naar subclone het PCR product gaat, moet u nucleotiden 5 ' van de beperkingsplaats toevoegen
Dit staat het beperkingsenzym toe om te binden aan en de beperkingsplaats efficiënter te snijden om te zijn.
De Opeenvolging van de de plaatsinleiding van de Beperking van het verbindingsstuk (die door inleidingsprogramma wordt ontworpen)
3 bp -- 6bp -- 15-22 bp
Pcr Subcloning
(Subclone betekent om het PCR product te klonen in een vector alvorens u het in uw vector van belang opneemt. De voordelen van dit omvat het feit dat u nooit PCR uw tussenvoegsel opnieuw moet, zult u het altijd in de koelkast hebben, en u kunt zo veel groeien aangezien u wilt gebruikend bacteriën.)
Vanuit onze ervaring, is de scherpe PCR producten gewoonlijk veel minder efficiënt dan scherpe fragmenten uit vectoren. Aldus, het snijden PCR kunnen de producten en het klonen van hen in uw vector direct niet zijn dat efficiënt en u probleem kunt hebben doend dit.
Dat is manier het subcloning in een subcloning vector is gewoonlijk best.
Vectoren TOPO
De vectoren TOPO zijn groot voor het subcloning, hoewel zij duur kunnen zijn. Zij zullen besparen u tijd uiteindelijk, en maken het klonen PCR producten gemakkelijker en efficiënter.
De reden voor dit is dat u DNA in een plasmide kunt gemakkelijk verteren. Het is efficiënter voor het beperkingsenzym aangezien het gemakkelijk kan binden aan en uw stuk verteren.
De nadelen zijn dat u efficiënte en geoptimaliseerde PCR voorwaarden moet hebben. De aanwezigheid van vele banden in uw PCR zal het moeilijk als niet onmogelijk maken om uw PCR product van belang te klonen.
U kunt gewoonlijk subclone uw PCR product binnen ongeveer 2 dagen. De afbinding vergt slechts 5 minuten en u kunt uw bacteriële kolonies plateren de dag van de afbinding. Zodra u kolonies de volgende dag plukt en hen in media kweekt, vergroot u niet alleen uw tussenvoegsel, hebt u ook nu een bacteriële kolonie van uw subcloned tussenvoegsel dat u met glycerol in de vloeibare stikstof kunt jarenlang bevriezen.
Dit helpt werkelijk wanneer u een ander concept met uw tussenvoegsel moet maken!