PCR ENZYMEN: PCR Polymerase

PCR Polymerase - de Uiteindelijke Gids

auteursrecht 2006 PCR POST

PCR Polymerase: Een inleiding

De keus van de polymerase van DNA die door PCR wordt aangewend wordt bepaald door de doelstellingen van het experiment. Er is nu een overvloed in de handel verkrijgbare enzymen om van dat te kiezen verschilt in hun thermische stabiliteit, processivity, en trouw. Het het meest meestal gebruikte en het meest uitgebreid bestudeerde enzym is de polymerase van DNA Taq.

Aanvankelijke PCR Polymerase

De polymerase van DNA die oorspronkelijk in de eerste PCR reacties worden gebruikt werden gehaald uit de bacterie Escherichia coli. Hoewel dit enzym een onschatbaar hulpmiddel voor veel moleculair gebruik van het biologieonderzoek in het verleden en zelfs vandaag was, had het vele nadelen in originele PCR. In PCR, moet de pcr reactie worden gedenatureerd door het double-stranded product van DNA na elke cyclus te verwarmen. Jammer genoeg, stelde het verwarmen ook onherroepelijk de polymerase van DNA van E. coli buiten werking. De verse gedeelten van enzym moesten manueel bij het begin van elke cyclus worden toegevoegd. Met 30-40 cycli van PCR, was dit een zeer afmattende en boring taak.

Wat werd vereist was een polymerase van DNA die tijdens de die bij 90°C wordt uitgevoerd of hetere de denaturatiestap van DNA stabiel bleef. Een ontdekking maakte de oplossing veel gemakkelijker. Bacterie Thermophilus aquaticus werd geïsoleerdj van de water hete lentes. Deze bacterie kon overleeft en verspreidt zich in de uiterst hoogwatertemperaturen van de hete lentes. De isolatie van de polymerase van DNA van deze bacterie bracht een PCR polymerase op die niet snel bij hoge temperaturen buiten werking werd gesteld. Gelfand et al. in Cetus zuiverde het bedrijf en kloonde met succes deze PCR polymerase nu geroepen (Thermophilus in het kort aquaticus) Polymerase Taq.

Dit stond 30-40 cycli van PCR versterking toe om zonder de behoefte worden gepresteerd om de PCR reactiebuis te openen en verse polymerase toe te voegen. Deze ook verminderde potentiële verontreiniging die zou kunnen worden geïntroduceerdt toen het toevoegen van polymerase manueel meer dan 20-30 keer in de originele PCR reacties. Ook, wegens de aard van de thermophilic bacterie en de polymerase, Taq functioneerde optimaal bij temperaturen die rond 72°C, de synthese van DNA toelaten om bij veel hoger worden uitgevoerd
temperaturen dan met het enzym van E. coli mogelijk was. Dit had het voordeel om de bundel van malplaatjeDNA toe te laten om bij een veel hogere trouw worden gekopiÃ˲rd toe te schrijven aan hogere strigency van PCR inleiding het ontharden. Dit verminderde verder niet-specifieke producten die vele vroegere PCR reacties hadden beïnvloed.

De Polymerase van DNA TAQ

Ook eenvoudig genoemd „Taq“ van de Polymerase van Taq, is een thermostable polymerase van DNA die in polymerasekettingreactie wordt gebruikt (PCR) om de de replicatiereactie van DNA in de PCR cyclus te katalyseren. Op deze wijze van versterking, kan PCR voor de aanwezigheid of de afwezigheid van een gen van belang in een biologische steekproef onderzoeken.

De polymerase van DNA van Taq

Moleculair model van de Polymerase van DNA Taq. De structuur van het kristal van DNA-Polymerase Taq toont een Nieuwe Richtlijn voor het structuur-Specifieke Domein van de Nuclease.

De polymerase van DNA van Taq verving de Polymerase van DNA E.Coli in PCR, wegens zijn thermostable eigenschappen. Taq werd eerst geïsoleerd$ van Thermus aquaticus, een bacterie die in de hete lentes en hydrothermale openingen leeft.

Taq was de eerste polymerase die de het denatureren voorwaarden (meer dan 90 °C) kon weerstaan die tijdens PCR het cirkelen worden vereist.

Taq heeft een e nzymatic halveringstijd bij 95°C van ongeveer 40 min. Voor meer eigenschappen van Taq, zie de hieronder lijst.

Één van de belangrijke nadelen van polymerase Taq is zijn lage replicatietrouw. Aangezien Taq exonuclease 3 ' aan 5 ' het corrigeren geen mechanisme heeft om een toevallige wanverhouding in de onlangs samengestelde bundel van DNA te vervangen, veroorzaakt Taq meer fouten dan het corrigeren polymerase zoals Pfu.

De polymerase van DNA van Taq ook is uniek in zoverre dat het PCR producten de overhangend gedeeltes met van A (Adenine) produceert. Dit werd gevonden vrij nuttig om te zijn, en was geëxploiteerd(om het Klonen van Ta en het klonen TOPO (Invitrogen) te veroorzaken. Deze methodes wenden een het klonen vector (of plasmide aan) die de overhangend gedeeltes van T (Thymine) bezitten. Dit laat afbinding toe gebruikend topoisomerase of ligase van DNA om snel met de overhangend gedeeltes van A van het PCR product worden verwezenlijkt

De Polymerase van DNA PFU

De polymerase van DNA van Pfu is een enzym dat in hyperthermophilic furiosus van archaeonPyrococcus wordt gevonden, waar het in vivo functioneert om DNA van het organisme te herhalen. In vitro, wordt Pfu gebruikt om DNA in de Kettingreactie van de Polymerase snel te vergroten, Waar het enzym de centrale functie van het kopiëren van een nieuwe bundel van DNA tijdens elke uitbreidingsstap dient.

De superioriteit van polymerase Pfu het belangrijkste verschil tussen Pfu en alternatieve enzymen is superieure de thermostabiliteit en „het corrigeren“ van Pfu eigenschappen in vergelijking met andere thermostable polymerase. In tegenstelling tot de polymerase van DNA Taq, bezit de polymerase van DNA Pfu exonuclease 3 ' aan 5 ' het corrigeren activiteit betekent, die dat het zijn manier langs DNA van 3 ' eind aan 5 ' werkt beëindigt en verbetert nucleotide-misincorporationfouten. Dit betekent dat de DNA polymerase-geproduceerde PCR Pfu fragmenten minder fouten dan taq-Geproduceerde PCR tussenvoegsels zullen hebben. Dientengevolge, wordt Pfu meer in het algemeen gebruikt voor het moleculaire klonen van PCR fragmenten dan historisch populaire Taq. In de handel verkrijgbare Pfu resulteert typisch in een foutentarief van 1 in 1.3 miljoen basisparen en kan 2.6% veranderde producten opbrengen bij het vergroten 1kb het gebruiken van PCR versplintert. Nochtans, is Pfu langzamer en vereist typisch 1-2 minuten om 1kb van DNA bij 72° C. te vergroten. Het gebruiken van de polymerase van DNA Pfu in PCR reacties resulteert ook in bot-gebeëindigde PCR producten. De polymerase van DNA van Pfu is vandaar superieur voor technieken die de synthese van hoog-trouwDNA vereisen, maar kan ook samen met polymerase worden gebruikt Taq om de trouw van Pfu met de snelheid van Taq polymeraseactiviteit te verkrijgen.

Geschiedenis

De wetenschappers die met het Biotech bedrijf Stratagene worden geassociÃ˲rd, die in La Jolla, Californië wordt gebaseerd ontdekten de superioriteit van Pfu over Taq in 1991. Zij publiceerden hun werk in het dagboekGen in December van dat jaar (Gen. 1991 12 Dec; 108 (1): 1-6). Het V.S.- Octrooi werd 5.489.523 verleend over exonuclease-ontoereikende Pfu in Februari 1996 terwijl de V.S. 5.545.552 over Pfu zelf werden verleend in Augustus 1996 patenteren.

PCR Polymerase

Samenvatting van Beschikbare PCR Polymerase en hun eigenschappen.

De Polymerase van DNA	Biologische Bron	5 '--3 ' Exonuclease Activiteit	3 '--5 ' Exonuclease Activiteit	95°C halveringstijd (min)	Commerciële Namen	Het leveren van Bedrijven	Het Tarief van de uitbreiding (nucleosides/s)	Het Tarief van de fout	Tijd (s) aan 1kb (72°C)
Taq	Thermus Aquaticus	+	-	40	AmpliTaq, Goud AmpliTaq	Promega, Roche, Invitrogen en vele anderen.	75	1 in 10^3	32
Pfu	Furiosus van Pyrococcus	-	+	120	PfuTurbo	Stratagene, Fermentas, Invitrogen onder anderen	60	1 in 1.3 x 10^6	60-120
Pwo	Woesei van Pyrococcus	-	+	N/A			N/A	N/A	N/A
Tfl	Thermas flavus	-	-
rTth	Thermophilus Themus	+	-	20
Tli	Litoris van Thermus	-	+	400	Opening
Tma	Maritima van Thermotoga	-	+	>50

PCR en Polymerase

PCR is uitgevoerd op DNA groter dan 10 kilobases, nochtans gemiddelde is PCR slechts honderden aan een paar duizend basissen van DNA. Het probleem met lange PCR is dat er een evenwicht tussen nauwkeurigheid en processivity van het enzym is. Gewoonlijk, langer het fragment, groter de waarschijnlijkheid van fouten.

PCR de Verwijzingen van Polymerase