Rechts-PCR
Keer de Kettingreactie van de Polymerase van de Transcriptie Om
De omgekeerde kettingreactie van de transcriptiepolymerase (rechts-PCR) is gebaseerd op de polymerasekettingreactie (PCR). Wat nog belangrijker is is het gebaseerd op het proces van omgekeerde transcriptie, welk omgekeerde transcribeert RNA in DNA en aanvankelijk van retroviruses geïsoleerd.
De technieken van rechts-PCR staat de vorming van DNA (bijkomende of exemplaarcDna) van RNA toe, dat de opeenvolging van RNA (zoals boodschapperscRna, mRNA) in de stabielere vorm van nucleic zuur, DNA opslaat. Deze omgekeerde transcriptie van RNA in zijn omgekeerde aanvullingscDna (DNA) is de eerste stap van een proces gewoonlijk in twee stappen van rechts-PCR. Voorts door RNA in DNA te kopiëren, kan men de opeenvolging dan vergroten DNA door inleidingen te gebruiken specifiek voor de opeenvolging van DNA. Deze versterking is de definitieve tweede belangrijkste stap van het proces in twee stappen van rechts-PCR.
Het Proces van rechts-PCR
De Eerste stap van rechts-PCR wordt bedoeld als "eerste bundelreactie". In de eerste-bundelreactie, bijkomende ook wordt genoemd DNA van DNA, gemaakt van het malplaatje van boodschapperscRna van belang gebruikend oligo dT (oligonucleotide binden poly-dTs handeling gelijkend op inleidingen en aan de opeenvolging 3 ' polyA die bij 3 ' UTR wordt gevestigd - onvertaald gebied, die in het meeste mRNAs) aanwezig zijn, dNTPs, en een RNA-Afhankelijke polymerase van DNA, omgekeerde transcriptase, door het proces van omgekeerde transcriptie.
Deze factoren worden gecombineerd in een omgekeerde transcriptasebuffer 1 uur bij 37°C. Nadat de omgekeerde transcriptasereactie volledig is, en DNA is samengesteld, wordt RNaseH toegevoegd (een de spijsverteringsenzym van RNA) die RNA vanaf de hybride RNA-DNA verteert. Na incubatie met RNaseH, standaard worden PCR of de polymerasekettingreactie geleid gebruikend de oligo inleidingen van DNA specifiek voor de opeenvolging van belang. Deze tweede stap wordt bedoeld als "tweede bundelreactie".
Aldus door de thermostable polymerase van DNA, stroomopwaarts en de stroomafwaartse inleidingen van DNA toe te voegen, wordt enige vastgelopen DNA dubbele vastgelopen en geworden, toestaand de opsporing van zelfs zeldzame of lage exemplaarmRNA opeenvolgingen door zijn bijkomende DNA te vergroten.
Toepassingen van rechts-PCR
De exponentiële versterking van bijkomende opeenvolging van mRNA of de opeenvolgingen van RNA via de omgekeerde kettingreactie van de transcriptiepolymerase staan voor een hoge techniek van de gevoeligheidsopsporing, toe waar het lage exemplaaraantal of de minder overvloedige molecules van RNA kunnen worden ontdekt. Het wordt ook gebruikt aan kloonmRNA opeenvolgingen die in de vorm van bijkomende DNA, bibliotheken van DNA (bibliotheken DNA) toelaten om worden gecreeerd die alle opeenvolgingen mRNA van genen bevatten die in een cel worden uitgedrukt. Voorts staat het de verwezenlijking van concepten DNA toe die door RT-PCR werden gekloond en de uitdrukking van genen bij RNA en eiwitniveaus voor verdere studie toestaan.