PCR Limitations and Disadvantages PCR begrensninger og ulemper
The High Sensitivity of PCR Den høye sensitiviteten av PCR
Due to the extremely high sensitivity of PCR, contamination from non-template PCR present in the lab environment (from bacteria, viruses, and your own DNA) presents a real problem. På grunn av ekstremt høy følsomhet av PCR, forurensning fra ikke-mal PCR stede i lab miljø (fra bakterier, virus, og ditt eget DNA) presenterer et reelt problem. Precautions therefore must be taken. Forholdsregler derfor må tas. Several steps can be taken to prevent and minimize PCR contamination including the use of aerosol barrier tip filters, laminar flow cabinet, and a special preparation area for PCR separate from the DNA isolation area. Flere tiltak kan iverksettes for å forebygge og minimere PCR kontaminering inkludert bruk av spraybaserte barriere spissen filtre, Laminar Flow kabinett, og en spesiell forberedelse område for PCR atskilt fra DNA-isolering området.
Polymerase Errors Polymerase Feil
DNA polymerase are not perfect by any means, however they are quite good at what they do. DNA polymerase er ikke perfekt på noen måte, men de er ganske gode på det de gjør. Mistakes and errors do happen in PCR by DNA polymerases in the test tube and in the human body. Feil og feil gjør skje i PCR av DNA polymerases i reagensglasset og i menneskekroppen. The polymerases used in PCR often lack 3' to 5' exonuclease activity such as Taq polymerase. Den polymerases brukes i PCR ofte mangler 3 'til 5' exonuclease aktivitet som Taq polymerase. This enzyme lacks the ability to correct misincorporated nucleotides, an activity which is present in higher eukaryotes. Dette enzymet mangler evnen til å korrigere misincorporated nucleotidene, en virksomhet som er til stede i høyere eukaryotes.
A polymerase lacking the 3' to 5' exonuclease activity has a higher error rate, around 1 in 10000 bases are misincorporated. En polymerase mangler det 3 'til 5' exonuclease aktivitet har en høyere feil rente, rundt 1 i 10000 baser er misincorporated.
Recombinant polymerases have been generated and other polymerases have been isolated which are available to more accurate PCR and have a variety of applications such as sequencing. Rekombinante polymerases har blitt generert og andre polymerases har blitt isolert som er tilgjengelig for mer nøyaktig PCR og har en rekke applikasjoner som for eksempel sekvensering.
Examples of polymerases with 3' to 5' exonuclease activity include: Vent, which is extracted from Thermococcus litoralis , Pfu which is extracted from Pyrococcus furiosus, and Pwo which is extracted from Pyrococcus woesii . Eksempler på polymerases med 3 'til 5' exonuclease aktivitet omfatter: ventilasjon, som er hentet fra Thermococcus litoralis, Pfu som er hentet fra Pyrococcus furiosus, og Pwo som er hentet fra Pyrococcus woesii.
PCR Polymerase Enzyme Proficiency and PCR Product Size / Length Limitations PCR Polymerase enzymet profesjonalitet og PCR-produktet størrelse / lengde begrensninger
DNA polymerase are proficient enough to efficiently amplify DNA products up to a few thousand basepairs (2-5 kb). DNA polymerase er dyktig nok til å effektivt forsterke DNA produkter opptil noen tusen basepairs (2-5 kb). PCRs of longer products are less efficient due to enzyme activity loss, and inaccuracies introduced by longer PCRs. PCRs av lengre produktene er mindre effektiv på grunn av enzym aktivitet tap, og unøyaktigheter introdusert av lengre PCRs. Adding fresh DNA polymerase helps with enzyme activity lost due to the half life of the polymerase, however this does not help when accurate PCR is required. Legge fersk DNA polymerase bidrar med enzym aktivitet tapt på grunn av en halv livet av polymerase imidlertid dette ikke hjelper når nøyaktig PCR er nødvendig.
It is possible to amplify PCR products up to 20kb using lower or slower heating cycles and special mixtures of polymerases. Det er mulig å forsterke PCR produktene opptil 20kb bruke lavere eller saktere oppvarming sykluser og spesielle blandinger av polymerases. Long and Accurate PCR is accomplished by using mixtures of processive polymerases and high fidelity Polymerases. Lang og presis PCR gjøres ved hjelp av blandinger av processive polymerases og High Fidelity Polymerases.