• PCR PCR
• Learn about PCR Lær om PCR
• Types of PCR Typer PCR
• PCR Links PCR Links
• PCR News PCR-nyheter
• PCR Troubleshooting PCR Feilsøking
• PCR Problems PCR-problemer
• PCR Books PCR Bøker
• PCR Forum PCR Forum
• Biology Resouces Biologisk ressurser
• Tell A Friend Tips en venn
• Bookmark Us! Bokmerk oss!
• Advertise on PCR Station! Annonser på PCR Station!

PCR ENZYMES: PCR Polymerases PCR enzymer: PCR Polymerases

PCR Polymerases - The Ultimate Guide PCR Polymerases - The Ultimate Guide

copyright 2006 PCR STATION Copyright 2006 PCR STATION

PCR Polymerases: An Introduction PCR Polymerases: En introduksjon

The choice of the DNA polymerase employed by PCR is determined by the goals of the experiment. Valget av DNA polymerase ansatt av PCR bestemmes av målene for forsøket. There are now a plethora of commercially available enzymes to choose from that differ in their thermal stability, processivity, and fidelity. Det finnes nå en mengde kommersielle enzymer for å velge mellom som avviker i sin termisk stabilitet, processivity og troskap. The most commonly used and most extensively studied enzyme is Taq DNA polymerase. Som er den vanligste og mest omfattende studert enzymet er Taq DNA polymerase.

Initial PCR Polymerases Opprinnelig PCR Polymerases

The DNA polymerases used originally in the first PCR reactions were extracted from the bacterium Escherichia coli . Den DNA polymerases brukes opprinnelig i første PCR reaksjoner ble hentet fra bakterie Escherichia coli. Although this enzyme was an invaluable tool for many molecular biology research uses in the past and even today, it had many disadvantages in the original PCR. Selv om dette enzymet var et uvurderlig hjelpemiddel for mange molekylærbiologi forskning bruker i det siste, og selv i dag, det hadde mange ulemper i den opprinnelige PCR. In PCR, the pcr reaction must be denatured by heating the double-stranded DNA product after each cycle. Unfortunately, heating also irreversibly inactivated the E. coli DNA polymerase. I PCR, den PCR reaksjonen må være denatured ved oppvarming av dobbel strandet DNA-produkt etter hver syklus. Dessverre oppvarming også irreversibly inactivated av E. coli DNA polymerase. Fresh aliquots of enzyme had to be added manually at the start of each cycle. Fersk aliquots av enzymet måtte legges til manuelt ved starten av hver syklus. With 30-40 cycles of PCR, this was a very laborious and boring task. Med 30-40 sykluser av PCR, dette var en svært strevsom og kjedelig oppgave.

What was required was a DNA polymerase that remained stable during the DNA denaturation step performed at 90°C or hotter. Hva var nødvendig var en DNA polymerase som holdt seg stabilt i løpet av DNA denaturation steg utført ved 90 ° C eller bedre. A discovery made the solution much easier. Et funn gjort løsningen mye enklere. The bacterium Thermophilus aquaticus was isolated from water hot springs. Den bakterie Thermophilus aquaticus ble isolert fra vann Hot Springs. This bacterium was able survive and proliferate in the extremely high water temperatures of the hot springs. Dette bakterie kunne overleve og sprer i ekstremt høy vanntemperatur i Hot Springs. Isolation of the DNA polymerase from this bacterium yielded a PCR polymerase that was not rapidly inactivated at high temperatures. Isolering av DNA polymerase fra denne bakterie resultert i en PCR polymerase som ikke var raskt inactivated ved høye temperaturer. Gelfand et al. Gelfand et al. at Cetus corporation successfully purified and cloned this PCR polymerase now called Taq ( T hermophilus aq uaticus in short) Polymerase. ved Cetus Corporation vellykket renset og klonet denne PCR polymerase nå kalles Taq (T hermophilus aq uaticus i korte) Polymerase.

This allowed a 30-40 cycles of PCR amplification to be performed without the need to open the PCR reaction tube and add fresh polymerase. Dette åpnet en 30-40 sykluser av PCR forsterker til å bli utført uten å måtte åpne PCR reaksjonen rør og legge til frisk polymerase. This also reduced potential contamination that could be introduced when adding polymerase manually over 20-30 times in the original PCR reactions. Dette også potensial for redusert forurensning som kan bli introdusert når de legger polymerase manuelt over 20-30 ganger i den opprinnelige PCR reaksjoner. Also, due to the nature of the thermophilic bacterium and the polymerase, Taq functioned optimally at temperatures around 72°C, allowing DNA synthesis to be performed at much higher Også, på grunn av beskaffenheten til thermophilic bakterie og polymerase, Taq fungert optimalt ved temperaturer rundt 72 ° C, slik at DNA-syntese som skal utføres på mye høyere
temperatures than was possible with the E. coli enzyme. temperaturer enn det som var mulig med E. coli enzymet. This had the advantage of allowing the template DNA strand to be copied at a much higher fidelity due to higher strigency of PCR primer annealing. Dette hadde fordelen av å la malen DNA strand for å bli kopiert på et mye høyere troskap på grunn av høyere strigency av PCR grunning Annealing. This further reduced non-specific products which had affected many earlier PCR reactions. Dette ytterligere redusert ikke-spesifikke produkter som hadde påvirket mange tidligere PCR reaksjoner.

TAQ DNA Polymerase TAQ DNA Polymerase

Taq Polymerase also simply termed "Taq", is a thermostable DNA polymerase used in polymerase chain reaction (PCR) to catalyze the DNA replication reaction in the PCR cycle. Taq Polymerase også ganske enkelt kalt "Taq", er en thermostable DNA polymerase som brukes i polymerase kjede-reaksjon (PCR) for å catalyze av DNA-replikering reaksjon i PCR syklus. In this manner of amplification, PCR is able to examine for the presence or absence of a gene of interest in a biological sample. På denne måten av forsterker, PCR er i stand til å undersøke for tilstedeværelse eller fravær av en genet av interesse i et biologisk sample.

Molecular model of Taq DNA Polymerase. Molecular modell av Taq DNA Polymerase. Crystal structure of Taq DNA-Polymerase Shows A New Orientation For The Structure-Specific Nuclease Domain. Krystallstruktur av Taq DNA-Polymerase viser en ny orientering av struktur-spesifikke Nuclease domene.

Taq DNA polymerase replaced E.Coli DNA Polymerase in PCR, due to its thermostable properties. Taq DNA polymerase erstattes E. coli DNA Polymerase i PCR, på grunn av sin thermostable egenskaper. Taq was first isolated from Thermus aquaticus , a bacterium that lives in hot springs and hydrothermal vents. Taq ble først isolert fra Thermus aquaticus, en bakterie som lever i varme kilder og hydrothermal Vents.

Taq was the first polymerase that was able to withstand the denaturing conditions (over 90 °C) required during PCR cycling. Taq var den første polymerase som var i stand til å tåle de denaturing forhold (over 90 ° C) kreves ved PCR sykling.

Taq has an e nzymatic halflife at 95°C of about 40 min. Taq har en e nzymatic halflife ved 95 ° C i ca 40 min. For more properties of Taq, see the table below. For mer egenskaper Taq, se tabellen nedenfor.

One of Taq polymerases' major disadvantages is its low replication fidelity. En av Taq polymerases' store ulempene er den lave replikering troskap. As Taq does not have 3' to 5' exonuclease proofreading mechanism to replace an accidental mismatch in the newly synthesized DNA strand, Taq produces more errors than proofreading polymerases such as Pfu. Som Taq ikke har 3 'til 5' exonuclease korrekturlesing mekanisme for å erstatte en utilsiktet mismatch i det nylig syntetiserte DNA strand, Taq produserer flere feil enn korrekturlesing polymerases som Pfu.

Taq DNA polymerase also is unique in that it produces PCR products with A (Adenine) overhangs. Taq DNA polymerase også er unik ved at den produserer PCR-produkter med A (Adenine) overhangs. This was found to be quite useful, and was exploited to produce TA Cloning and TOPO cloning (Invitrogen). Dette ble funnet å være ganske nyttig, og ble benyttet til å produsere TA Cloning og Topo kloning (Invitrogen). These methods employ a cloning vector (or plasmid) which possesses T (Thymine) overhangs. Disse metodene benytter en kloning vektor (eller plasmid), som besitter T (Thymine) overhangs. This allows ligation using topoisomerase or DNA ligase to quickly be accomplished with the A overhangs of the PCR product Dette gjør at ligation hjelp topoisomerase eller DNA ligase til raskt å bli med på A-overhangs av PCR-produkt

PFU DNA Polymerase PFU DNA Polymerase

Pfu DNA polymerase is an enzyme found in the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus, where it functions in vivo to replicate the organism's DNA. Pfu DNA polymerase er et enzym som finnes i hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus, der den fungerer i vivo å gjenskape organisme's DNA. In vitro, Pfu is used to quickly amplify DNA in the Polymerase Chain Reaction, where the enzyme serves the central function of copying a new strand of DNA during each extension step. In vitro, Pfu brukes til raskt å forsterke DNA i Polymerase Chain Reaction, der enzymet fungerer den sentrale funksjonen til å kopiere en ny strand av DNA i hver forlengelse trinn.

Superiority of Pfu polymerase The main difference between Pfu and alternative enzymes is Pfu's superior thermostability and 'proofreading' properties compared to other thermostable polymerases. Overlegenhet over Pfu polymerase Den største forskjellen mellom Pfu og alternative enzymer er Pfu overlegne thermostability og "korrekturlesing" egenskaper i forhold til andre thermostable polymerases. Unlike Taq DNA polymerase, Pfu DNA polymerase possesses 3' to 5' exonuclease proofreading activity, meaning that it works its way along the DNA from the 3' end to the 5' end and corrects nucleotide-misincorporation errors. I motsetning Taq DNA polymerase, Pfu DNA polymerase besitter 3 'til 5' exonuclease korrekturlesing aktivitet, noe som betyr at den fungerer på sin vei langs DNA fra 3 'ende til 5' enden og retter nucleotide-misincorporation feil. This means that Pfu DNA polymerase-generated PCR fragments will have fewer errors than Taq-generated PCR inserts. Dette betyr at Pfu DNA polymerase-generert PCR fragmenter vil ha færre feil enn Taq-generert PCR omslag. As a result, Pfu is more commonly used for molecular cloning of PCR fragments than the historically popular Taq. Som et resultat Pfu oftere brukes for molekylær kloning av PCR fragmenter enn det historisk populære Taq. Commercially available Pfu typically results in an error rate of 1 in 1.3 million base pairs and can yield 2.6% mutated products when amplifying 1kb fragments using PCR. Kommersielt tilgjengelig Pfu vanligvis resulterer i en feil hastighet på 1 i 1,3 millioner base par og kan gi 2,6% mutert produkter når forsterke 1kb fragmenter ved hjelp av PCR. However, Pfu is slower and typically requires 1–2 minutes to amplify 1kb of DNA at 72° C. Using Pfu DNA polymerase in PCR reactions also results in blunt-ended PCR products. Men Pfu er tregere og krever vanligvis 1-2 minutter å forsterke 1kb av DNA på 72 ° C. Bruk Pfu DNA polymerase i PCR reaksjoner også resultater i likefram-endte PCR produktene. Pfu DNA polymerase is hence superior for techniques that require high-fidelity DNA synthesis, but can also be used in conjunction with Taq polymerase to obtain the fidelity of Pfu with the speed of Taq polymerase activity. Pfu DNA polymerase er dermed overlegen på teknikker som krever high-fidelity DNA-syntesen, men kan også brukes i forbindelse med Taq polymerase å få fidelity av Pfu med hastigheten på Taq polymerase aktivitet.

History

Scientists associated with the biotech company Stratagene, based in La Jolla, California discovered the superiority of Pfu over Taq in 1991. Forskere knyttet til bioteknologisk selskap Stratagene, basert i La Jolla, California oppdaget suvereniteten til Pfu over Taq i 1991. They published their work in the journal Gene in December of that year (Gene. 1991 Dec 12;108(1):1-6). De publiserte sitt arbeid i tidsskriftet Gene i desember samme år (Gene. 1991 desember 12, 108 (1) :1-6). US Patent 5,489,523 was granted over exonuclease-deficient Pfu in February 1996 while US Patent 5,545,552 over Pfu itself was granted in August 1996. US Patent 5489523 ble innvilget over exonuclease-mangelfull Pfu i februar 1996 mens US Patent 5545552 over Pfu selv ble innvilget i august 1996.

PCR Polymerases PCR Polymerases

Summary of Available PCR Polymerases and their properties. Oppsummering av tilgjengelig PCR Polymerases og deres egenskaper.

PCR and Polymerases PCR og Polymerases

PCR has been performed on DNA larger than 10 kilobases, however the average PCR is only several hundred to a few thousand bases of DNA. PCR har vært utført på DNA-større enn 10 kilobases imidlertid gjennomsnittlig PCR er bare noen hundre til noen tusen baser i DNA. The problem with long PCR is that there is a balance between accuracy and processivity of the enzyme. Problemet med lange PCR er at det er en balanse mellom nøyaktighet og processivity av enzymet. Usually, the longer the fragment, the greater the probability of errors. Vanligvis, jo lenger den fragment, desto større er sannsynligheten for feil.

PCR Polymerases References PCR Polymerases referanser

1.

2.

3.

copyright 2006 PCR STATION Copyright 2006 PCR STATION