PCR Limitations and Disadvantages PCR ograniczenia i wady
The High Sensitivity of PCR Wysokie czułości PCR
Due to the extremely high sensitivity of PCR, contamination from non-template PCR present in the lab environment (from bacteria, viruses, and your own DNA) presents a real problem. Ze względu na niezwykle wysoką czułość PCR, zanieczyszczenia spoza szablonu PCR obecne w środowisku laboratoryjnym (z bakterii, wirusów i własne DNA) stanowi prawdziwy problem. Precautions therefore must be taken. W związku z tym środki ostrożności muszą zostać podjęte. Several steps can be taken to prevent and minimize PCR contamination including the use of aerosol barrier tip filters, laminar flow cabinet, and a special preparation area for PCR separate from the DNA isolation area. Kilka kroki mogą zostać podjęte w celu zapobiegania i minimalizacji skażenia PCR w tym wykorzystanie aerozoli barierę wskazówka filtry, laminarnym gabinetu, a także przygotowanie specjalnego obszaru PCR oddzielone od strefy izolacji DNA.
Polymerase Errors Błędy polimerazy
DNA polymerase are not perfect by any means, however they are quite good at what they do. Polimeraza DNA nie są idealne w dowolny sposób, jednak są one dość dobre, co robią. Mistakes and errors do happen in PCR by DNA polymerases in the test tube and in the human body. Pomyłek i błędów w to miejsce przez PCR polimerazy DNA w probówce testowej i w ciele ludzkim. The polymerases used in PCR often lack 3' to 5' exonuclease activity such as Taq polymerase. W polimerazy PCR często używane w braku 3 'do 5' exonuclease działalności, takie jak polimeraza Taq. This enzyme lacks the ability to correct misincorporated nucleotides, an activity which is present in higher eukaryotes. Enzym ten nie posiada zdolności do prawidłowego misincorporated nukleotydy, działalności, która jest obecna w wyższej eukaryotes.
A polymerase lacking the 3' to 5' exonuclease activity has a higher error rate, around 1 in 10000 bases are misincorporated. A polimerazy brakuje 3 'do 5' exonuclease działalność ma wyższy wskaźnik błędu, około 1 na 10000 podstawy są misincorporated.
Recombinant polymerases have been generated and other polymerases have been isolated which are available to more accurate PCR and have a variety of applications such as sequencing. Rekombinacji polimerazy zostały wygenerowane i inne polimerazy zostały odizolowane, które są dostępne dla bardziej dokładne PCR i różnorodnych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie.
Examples of polymerases with 3' to 5' exonuclease activity include: Vent, which is extracted from Thermococcus litoralis , Pfu which is extracted from Pyrococcus furiosus, and Pwo which is extracted from Pyrococcus woesii . Przykłady polimerazy z 3 'do 5' exonuclease działalności obejmują: Vent, który jest wyodrębniony z Thermococcus litoralis, PFU, który jest wyodrębniony z Pyrococcus furiosus i Pwo który jest wyodrębniony z Pyrococcus woesii.
PCR Polymerase Enzyme Proficiency and PCR Product Size / Length Limitations Biegła enzymu polimerazy PCR i PCR produktu Rozmiar / długość ograniczeń
DNA polymerase are proficient enough to efficiently amplify DNA products up to a few thousand basepairs (2-5 kb). Polimeraza DNA są na tyle biegle, aby sprawnie podkreślają DNA produkty do kilku tysięcy basepairs (2-5 KB). PCRs of longer products are less efficient due to enzyme activity loss, and inaccuracies introduced by longer PCRs. PCRS dłuższych produkty są mniej wydajne z powodu utraty aktywności enzymu, a nieścisłości wprowadzone przez dłuższy PCRS. Adding fresh DNA polymerase helps with enzyme activity lost due to the half life of the polymerase, however this does not help when accurate PCR is required. Dodawanie świeże polimeraza DNA pomaga w aktywności enzymu utracone ze względu na okres półtrwania leku w polimerazy, jednak to nie pomoże, gdy wymagane jest dokładne PCR.
It is possible to amplify PCR products up to 20kb using lower or slower heating cycles and special mixtures of polymerases. Jest to możliwe do nagłaśniania produktów PCR do 20KB lub wolniej przy użyciu niższych cykli ogrzewania i specjalnych mieszanek polimerazy. Long and Accurate PCR is accomplished by using mixtures of processive polymerases and high fidelity Polymerases. PCR Dokładne długo i jest dokonywane przy użyciu mieszanki processive polimerazy polimerazy i wysokiej wierności.