PCR Product Sequencing Sekwencjonowanie produktu PCR
How To Sequence Your PCR Products Jak sekwencji Twoje produkty PCR
Once you amplify your DNA sequence of interest, you usually need to check the amplification quality and accuracy using DNA sequencing services. Po amplifikacji sekwencji DNA swoje zainteresowania, zwykle trzeba sprawdzić wzmocnienie jakości i dokładności przy użyciu usług sekwencjonowania DNA. There are several methods to do this and each method has its advantages and disadvantages. Istnieje kilka metod, aby to zrobić i każda metoda ma swoje wady i zalety.
Direct Sequencing of PCR Products Bezpośrednie sekwencjonowanie produktów PCR
Direct sequencing of PCR products is obviously the quickest method although it is not always the most successful method. Bezpośrednie sekwencjonowanie produktów PCR jest najszybszej oczywiście metoda, choć nie zawsze jest najbardziej udanych metody. It is possible to directly sequence a PCR product without having first cloned the fragment into a sub-cloning vector such as a TOPO plasmid. Jest możliwe bezpośrednio sekwencji jeden produkt PCR bez pierwsze sklonowane fragment do sub-klonowanie wektorowej, takich jak Topo plazmidu. Obviously there are many advantages to the direct sequencing approach. Oczywiście istnieje wiele zalet do bezpośredniego sekwencjonowania podejście. However, there are several disadvantages and steps which many people bypass only to have failed DNA sequencing results. Jednakże, istnieje kilka wad i kroki, które wielu ludzi obwodnicy nie tylko wyniki sekwencjonowania DNA.
Direct sequencing of PCR fragments is hardly successful unless you learn how to make it successful. Bezpośredniego sekwencjonowania PCR fragmenty nie jest udane, chyba że można dowiedzieć się, jak uczynić go sukcesem. We have generated the following tips to make sure you don't fail in your direct sequencing attempts. Mamy generowane następujących wskazówek upewnij się, że nie zawiodą w bezpośrednie sekwencjonowanie prób.
1) Make sure that you have the right PCR product before you send your PCR product for sequencing. 1) Upewnij się, że masz prawo PCR produkt przed wysłaniem Twój produkt PCR dla sekwencjonowanie.
With sub-cloning PCR products into a vector, people usually restriction enzyme digest the bands out of the vector to check if it is the right sequence. Z sub-klonowania produktów PCR do wektora, ludzie zazwyczaj ograniczenie enzym digest pasm obecnie wektora, aby sprawdzić, czy jest to prawo sekwencji. Make sure you check the size of your PCR product carefully on the gel before you send it for sequencing. Upewnij się, sprawdź rozmiar produktu dokładnie PCR na żelu przed wysłaniem go do sekwencjonowania. Also, if there are known restriction sites in the PCR fragment, make sure you use these to check that your product is the right one. Również, jeżeli nie są znane ograniczenia w witrynach PCR fragment, upewnij się, że korzystanie z nich, aby sprawdzić, czy produkt jest prawo jednego.
2) Make sure you don't have many non-specific products (bands on agarose gel)! 2) Należy upewnić się, że nie mają wiele nie konkretnych produktów (pasm na żelu agarozowym)!
PCR reactions rarely produce only a single (one) band. Reakcji PCR rzadko produkują tylko jeden (jeden) zespół. Usually you will have many bands (non-specific products). Zwykle trzeba będzie wiele pasm (bez konkretnych produktów). Even if you can't see them, your PCR reaction may have many bands (non-specific products) that will cause your DNA sequencing to have many signals at each nucleotide (you get a jumbled sequence ie N (all 4 nucleotides) instead of 1 nucleotide). Nawet jeśli nie można ich zobaczyć, Twoje reakcji PCR może mieć wiele pasm (bez konkretnych produktów), które spowoduje ponowne sekwencjonowanie DNA, aby mieć wiele sygnałów w każdym nukleotydów (pojawi się pogmatwany sekwencji tzn. N (wszystkie 4 nukleotydy) zamiast 1 nukleotydów).
Using nested PCR primers can reduce this problem. Korzystanie z zagnieżdżonych aparat PCR może zmniejszyć ten problem. It is also less likely that non-specific product will co-amplify through a second round of PCR with internally- Jest także mniej prawdopodobne, że określony produkt nie będzie współfinansować wzmacniać poprzez drugiej rundzie PCR z wewnątrz -
nested primers. zagnieżdżonych pierwsze.
3) Remove all residual PCR primers and unincorporated nucleotides before sequencing. 3) Usuń wszystkie resztkowego aparat PCR i bez osobowości prawnej przed sekwencjonowania nukleotydów.
The good thing with sub-cloning is that you clone in the PCR fragment into the vector, amplify it, and purify it. Dobrą rzeczą podprogramów z klonowania jest klonem, który w PCR fragment do wektora, wzmacniać go, i oczyści go. This way you have a very clean batch of DNA. W ten sposób masz bardzo czystych partii DNA. After PCR amplification however, you have a lot of unincorporated nucleotides, pcr primers, salts and proteins that can interfere with DNA sequencing. Po amplifikacji PCR jednak masz sporo nieposiadającymi nukleotydy, aparat PCR, soli i białka, które mogą kolidować z sekwencjonowanie DNA. Make sure you at least use a PCR clean-up step to ensure your DNA sequencing doesn't fail. Upewnij się, że co najmniej używać PCR clean-up krok, aby zapewnić sekwencjonowanie DNA nie zawiedzie.
4) Ensure you don't send a very concentrated DNA sample! 4) Zapewnienie nie wysyła bardzo skoncentrowany próbki DNA!
Make sure that you double-check the template DNA concentrations before you send your PCR for sequencing. Upewnij się, że dwukrotnie sprawdzić matrycowego DNA koncentracji przed wami wysłać do sekwencjonowania PCR. This is because PCR fragments are smaller than plasmids, and thus you get more DNA per sample. Dzieje się tak dlatego, PCR fragmenty są mniejsze niż plazmidów, a tym samym pojawi się więcej na próbkę DNA. This makes PCR products more effective sequencing templates than the usual plasmids. To sprawia, że produkty PCR, sekwencjonowanie szablony bardziej skuteczne niż zwykłe plazmidy. Therefore you need to have lower concentrations for PCR products. Dlatego musisz mieć niższe stężenia dla produktów PCR.
For example, a 200 bp fragments needs to be just 2 ng/ul! Na przykład, 200 bp fragmenty musi być tylko 2 ng / ul! If your samples are at too high a concentration, not only will they NOT sequence any better but may cause your DNA sequencing to fail. Jeśli Twoje próbki są na zbyt wysokim stężeniu, nie tylko nie będą one lepiej jakiejkolwiek kolejności, ale może spowodować sekwencjonowanie DNA na porażkę. Estimate your PCR product concentration by loading them with standards on an agarose gel. Szacujemy, że jego stężenie produktu PCR przez ich załadowanie z normami na żelu agarozowym. Usually laboratory spectrophotometers cannot with accurately measure the small amount of DNA that a PCR reaction generates (unless you use the newer micro-specs ie "Nanodrop"). Zwykle laboratorium spectrophotometers nie może z dokładnego pomiaru małych ilości DNA, że generuje reakcji PCR (chyba że używana jest nowsza mikro specyfikacją tzn. "Nanodrop"). Based on your analysis, make sure you dilute them. W oparciu o swoje analizy, upewnij się, że je rozcieńczyć.
Subcloning PCR Products and Sequencing them Subcloning Produkty PCR i ich Sekwencjonowanie
The most effective way to sequence PCR products is by subcloning them into vectors or plasmids. Najskuteczniejszym sposobem sekwencji produktów PCR subcloning jest przez nich na wektory lub plazmidy. Usually this was done with primers that contained restriction enzyme sites. Zwykle było to zrobione, że pierwsze z zawartych ograniczenie enzym witryn. There were many problems with this including the fact that restriction enzymes have difficulties cutting at the ends of a PCR fragment. Było wiele problemów z tą łącznie z faktem, że enzymy restrykcyjne mają trudności cięcia końcówkami do PCR fragment.
After cutting the PCR fragment, one would have to ligate the PCR fragment into a pre-cut vector that has compatible ends. Po pokrojeniu PCR fragment, jeden musiałby ligate PCR fragment w pre-cut, że wektor jest zgodna kończy. After amplification and purification of the plasmid, one would simply send the fragment for DNA sequencing. Po amplifikacji i oczyszczania plazmid, jeden po prostu wysłać fragment do sekwencjonowania DNA. Most vectors have T7, T3, M13, and other primer sites which allows easy DNA sequencing using universal primers (such as the commonly available T7 primer, T3 primer, and M13 primers). Większość nosicieli mają T7, T3, M13, primery i inne miejsca, które pozwala na łatwe sekwencjonowanie DNA przy użyciu starterów uniwersalnych (takich jak powszechnie dostępne primer T7, T3 primery, primery i M13).
TOPO Vectors for PCR sub-cloning Topo nośniki sub-PCR, klonowanie
The latest greatest innovations allowed many to bypass the difficulties or subcloning PCR products into regular vectors. Najnowsze największych innowacji pozwoliły wielu pominąć trudności lub subcloning produktów PCR w regularnych wektorów. TOPO cloning allowed the RAPID and easy cloning of PCR products into vectors. Topo klonowania umożliwiło szybkie i łatwe klonowania produktów PCR do wektorów. TOPO cloning is very quick (5 minutes for ligation) and very effective. Topo klonowania jest bardzo szybki (5 minut ligation) i bardzo skuteczne. You can easily clone your PCR fragment into the vector without any restriction sites. Możesz łatwo klon swój PCR fragment do wektora bez żadnych ograniczeń witryn. This is due to the fact that many DNA polymerases add an extra A to the ends of the DNA fragment. Wynika to z faktu, że wiele polimerazy DNA, dodać dodatkową A do końców fragmentu DNA. This allowed the cloning of the PCR fragments into TOPO vectors (or TA vectors) which contained free T ends. Pozwoliło to klonowanie PCR fragmenty w Topo wektory (lub wektorów TA), która zawierała wolne T kończy. TOPO vectors contain Topoisomerase enzyme which enhances the cloning of PCR fragments into the vector. Topo Topoisomerase wektory zawierają enzym, który przyczynia się do klonowania fragmentów PCR do wektora.
TOPO vectors are available at Invitrogen Topo wektory są dostępne na Invitrogen
Copyright 2006 PCR Station Copyright 2006 PCR stacji