Colônia PCR
Que é a colônia PCR?
A definição da colônia PCR é:
A colônia PCR a seleção de bacteriano (E.Coli) ou do fermento clones para produtos corretos do ligation ou do plasmid. As colônias selecionadas das bactérias ou do fermento são escolhidas com uma ponta sterile do toothpick ou da pipeta de uma placa do crescimento (agarose). Isto então é introduzido na mistura do mestre de PCR ou pre-introduzido na água autoclaved. PCR está conduzido então para determinar se a colônia contiver o fragmento do DNA ou o plasmid do interesse.
Protocolo Bacteriano Da Colônia PCR De E.Coli
Método Rápido Da Preparação Da Colônia PCR
Etapa 1:
Escolha uma colônia bacteriana com uma ponta autoclaved do toothpick ou da pipeta e rode ele em 25 μlitros de dH2O autoclaved TE em um tubo autoclaved do microfuge. Não remova a colônia inteira, e marque a área que você escolheu preferrably o número o fundo da placa (e do tubo do microfuge).
Etapa 2:
Aqueça a mistura em um banho da água fervendo ou o bloco
quente do heating (90-100C) por 2 minutos
Etapa 3:
Gire a amostra por 2 minutos de alta velocidade no centrifugador.
Etapa 4:
Transfira 20 μlitros do supernatant em um tubo novo do microfuge.
Etapa 5:
Faça exame de 1-2 μlitro do supernatant como o molde em uns 25 μlitros reação padrão de PCR PCR.
Protocolo Da Colônia PCR Do Fermento
Faça exame das pilhas do fermento que foram crescidas em uma placa fresca do incubator 37C (o fermento recentemente crescido é melhor)
Faça exame de uma ponta autoclaved do toothpick ou da pipeta e toque em um pouco de colônia do fermento. Não raspe afastado uma colônia inteira. Suspenda-o em um mastermix padrão de PCR.
Condições Dando um ciclo de PCR:
Primeira Etapa Desnaturando: 95 °C, 5 minutos
Desnaturando A Etapa: 95 °C, 30 segundo
Etapa Do Recozimento: 50-55 °C, 30 segundo
Etapa Da Extensão: 72 °C, 1min/kb
Repita a etapas 2-4: 34 vezes
Extensão Final: 72 °C, 3 minutos
Carregue a reação inteira de PCR no gel do agarose de 1%.
Colônia PCR - Pesquisa Publicada Pubmed
PCR direto das bactérias intatas (colônia PCR). Artigos Relacionados
PCR direto das bactérias intatas (colônia PCR).
Microbiol De Curr Protoc. May;Appendix 2008 3:Appendix 3D
Autores: Woodman MIM
Este protocolo descreve um método eficiente para selecionar as bactérias intatas para a presença de seqüências desejadas do DNA usando a reação chain do polymerase (PCR). Este método é consultado geralmente como à colônia PCR.
PMID: 18770531 [ PubMed - no processo ]