PCR in situ
Definição do PCR in situ
O PCR in situ (ISH) é uma reacção em cadeia do polymerase que ocorra realmente dentro da pilha em uma corrediça. A amplificação in situ do PCR pode ser executada em tecido ou em pilhas fixas.
Introdução in situ do PCR
Durante a iniciação e a progressão da doença, as quantidades minuciosas de um produto em populações pequenas das pilhas ou os tecidos podem ser vitais para a patogénese da doença.
Em muitas doenças lento-em desenvolvimento que exigem meses ou mesmo anos para se manifestar clìnica, mostrou-se que a maioria da população afetada da pilha está em um estado transcriptionally inativo, e a nível de um gene por a pilha de anfitrião.
Os métodos da hibridação do ácido nucleico e a reacção em cadeia do polymerase (PCR) ambos foram empregados examinar a expressão e a deteção de tais genes afetados durante a patogénese. Quando ambas estas técnicas forem completamente úteis, a desvantagem destas técnicas é que estão conduzindo essencialmente estudos da expressão e de população da pilha. Os ácidos nucleicos são isolados de uma população das pilhas que contenha um suficiente número de moléculas para detectar diretamente por técnicas padrão da hibridação, ou, quando uma subpopulação contem tão pouco quanto uma única cópia do ácido nucleico, dessa molécula amplificada pelo PCR, e detectada após a amplificação.
A hibridação in situ (ISH) aplica a metodologia da técnica da hibridação do ácido nucleico ao nível celular. Combinar o cytochemistry e o PCR immunocytochemistry, in situ permite que a identificação de marcadores celulares seja identificada, e permite mais a localização a seqüências específicas da pilha dentro das populações da pilha, tais como tecidos e amostras de sangue.
O PCR in situ é limitado à deteção do material non-genomic tal como o RNA, os genes ou os genomas, porque o limite de deteção em a maioria de circunstâncias é diversas cópias do ácido nucleico do alvo por a pilha. Conseqüentemente, devido às limitações do número de cópia, hibridação do RNA é mais sensível do que a deteção do ADN.
Os fatores que afetam a sensibilidade in situ do PCR incluem:
1) o strandedness da molécula do alvo
2) a falta de uma seqüência complementar proximal às seqüências do alvo
Inverta a transcrição in situ transcriptase-catalisada foi usado mesmo para detectar RNAs que ocorrem no número de cópia relativamente elevado.
PCR in situ (ISH) Protcol
Inicialmente o stoichiometry dos componentes de ácido nucleico faz a reação primeira demão-conduzida. Enquanto a reação prosigue entretanto, o produto próprio do PCR começa a funcionar como um alvo para uma amplificação mais adicional, e também uma primeira demão para um alongamento mais adicional. É a acumulação de seqüências prolongadas em reações múltiplas que é retida pela pilha fixa e actua como o alvo para a ponta de prova radiolabeled na fase da deteção.
A natureza física complexa dentro de uma pilha fixa impede a eficiência do polymerase e também a difusão e o recozimento, e assim os tempos do alongamento são muito mais longos do que aqueles conduzidos sob (PCR padrão) as condições aquosas. O sinal o melhor producted geralmente usando um alongamento 15 minuto.