In Situ PCR PCR in situ
Definition of In Situ PCR Definição de PCR in situ
In Situ PCR (ISH) is a polymerase chain reaction that actually takes place inside the cell on a slide. In situ PCR amplification can be performed on fixed tissue or cells. PCR in situ (ISH) é uma reação em cadeia da polimerase que realmente ocorre no interior das células em um slide. In situ PCR pode ser realizada em tecidos ou células fixas.
In Situ PCR Introduction PCR in situ Introdução
During the initiation and progression of disease, minute quantities of a product in small populations of cells or tissues may be vital for the pathogenesis of the disease. Durante o início e progressão da doença, minuta de um produto em quantidades pequenas populações de células ou tecidos pode ser decisiva para a patogênese da doença.
In many slowly-evolving diseases which require months or even years to manifest themselves clinically, it has been shown that the majority of the affected cell population is in a transcriptionally inactive state, and at a level of one gene per host cell. Em muitas doenças que evoluem lentamente-requerem meses ou até anos para se manifestam clinicamente, foi mostrado que a maioria da população é afetada célula transcriptionally em um estado inativo, e com um nível de um gene por célula hospedeira.
Nucleic acid hybridization methods and the polymerase chain reaction (PCR) have both been employed to examine the expression and detection of such affected genes during pathogenesis. Ácidos nucleicos e hibridação métodos reação em cadeia da polimerase (PCR) têm sido empregadas tanto para analisar a expressão e detecção de tais genes afetado pathogenesis durante. While both these techniques are quite useful, the disadvantage of these techniques is that they are essentially conducting cell expression and population studies. Embora ambas estas técnicas são bastante úteis, a desvantagem destas técnicas é que elas estão essencialmente realizando célula expressão e estudos populacionais. Nucleic acids are isolated from a population of cells which contains either a sufficient number of molecules to detect directly by standard hybridization techniques, or, when a subpopulation contains as little as a single copy of nucleic acid, that molecule amplified by the PCR, and detected after amplification. Ácidos nucléicos são isoladas a partir de uma população de células que contém quer um número suficiente de moléculas de detectar diretamente pela norma técnicas de hibridação, ou, quando uma subpopulação contém tão pouco como uma única cópia do ácido nucleico, que a molécula amplificado pela PCR, e detectou após amplificação.
In situ hybridization (ISH) applies the methodology of the nucleic acid hybridization technique to the cellular level. Hibridização in situ (ISH) aplica a metodologia da técnica de hibridização de ácidos nucleicos a nível celular. Combining cytochemistry and immunocytochemistry, In Situ PCR allows the identification of cellular markers to be identified, and further permits the localization of to cell specific sequences within cell populations, such as tissues and blood samples. Combinando citoquímica e imunocitoquímica, In Situ PCR permite a identificação de marcadores celulares de ser identificado, e ainda permite a localização de seqüências específicas para celulares dentro de populações celulares, tais como tecidos e amostras de sangue.
In Situ PCR is limited to the detection of non-genomic material such as RNA, genes or genomes, as the detection limit in most conditions is several copies of the target nucleic acid per cell. In Situ PCR limita-se à detecção de material não-genômica, como RNA, genes ou genomas, como o limite de detecção na maioria das condições é o alvo de várias cópias de ácidos nucleicos por célula. Therefore, due to copy number limitations, hybridization of RNA is more sensitive than DNA detection. Portanto, devido ao número cópia limitações, hibridização do RNA é mais sensível que a detecção de DNA.
Factors affecting In Situ PCR sensitivity include: Factores que afectam a sensibilidade da PCR In Situ incluem:
1) the strandedness of the target molecule 1) o strandedness da molécula-alvo
2) the lack of a complementary sequence proximal to the target sequences 2) a falta de uma seqüência complementar proximal ao alvo seqüências
Reverse transcriptase-catalyzed in situ transcription has even been used to detect RNAs which occur at relatively high copy number. Transcriptase reversa não-catalisada in situ transcrição foi mesmo usada para detectar RNAs que ocorrem em número relativamente elevado cópia.
In Situ PCR (ISH) Protcol PCR in situ (ISH) Protcol
Initially the stoichiometry of the nucleic acid components makes the reaction primer-driven. Inicialmente, o Estequiometria do ácido nucleico componentes torna a reação primer-driven. As the reaction proceeds however, the PCR product itself begins to function as a target for further amplification, as well as a primer for further elongation. Quanto à reacção prossegue no entanto, o produto da PCR propriamente dita começa a funcionar como um alvo para uma maior amplificação, bem como um primer para posterior alongamento. It is the accumulation of sequences elongated in multiple reactions which is retained by the fixed cell and acts as the target for the radiolabeled probe in the detection phase. É o acúmulo de seqüências alongados em múltiplas reações que é retida pelo fixa e celular funciona como o alvo para o radiomarcado sonda na fase de detecção.
The complex physical nature within a fixed cell impedes both the efficiency of the polymerase as well as diffusion and annealing, and thus elongation times are much longer than those conducted under aqueous (standard PCR) conditions. A complexa natureza física dentro de uma célula fixo dificulta tanto a eficiência da polimerase, bem como divulgação e anelamento, e, portanto, alongamento vezes são muito mais tempo do que as realizadas ao abrigo aquoso (padrão PCR) condições. Optimum signal is usually producted using a 15 minute elongation. Óptimo sinal é geralmente producted usando a 15 minutos de alongamento.