PCR inverso
Fundo inverso do PCR
O PCR inverso igualmente chamou IPCR, e foi descrito primeiramente por Ochman e outros em 1988 (1).
Uma limitação do PCR padrão é que 5 ' e 3 ' regiões flanqueando de seu fragmento do ADN do interesse devem ser sabidas. O PCR inverso permite que você conduza o PCR quando você tem somente a informação de uma seqüência interna.
A reacção em cadeia inversa do polymerase é uma variação do PCR, e é usada quando somente uma seqüência interna do ADN do alvo é sabida. É conseqüentemente muito útil em identificar seqüências flanqueando do ADN de inserções genomic. Similar a outros métodos do PCR, o PCR inverso amplifica o ADN do alvo usando o polymerase de ADN.
O PCR inverso usa PCR padrão (reacção em cadeia do polymerase), porém tem as primeiras demão orientadas no sentido reverso da orientação usual. O molde para as primeiras demão reversas é um fragmento da limitação que seja ligado em cima dse para dar forma a um círculo.
O método inverso do PCR
O método inverso do PCR inclui uma série de digestões e de auto-ligadura com o ADN que está sendo cortado por um endonuclease da limitação. Este corte conduz a uma seqüência conhecida em um ou outro fim de seqüências desconhecidas.
Etapas inversas do PCR
1) O ADN do alvo é cortado levemente em fragmentos menores de diversos kilobases pela digestão do endonuclease da limitação.
) a Auto-ligadura 2 é induzida sob as baixas concentrações que fazem com que a espinha dorsal do fosfato reforme. Isto dá um produto circular da ligadura do ADN.
3) O ADN do alvo é então limitação digerida com um endonuclease conhecido. Isto gera um corte dentro da seqüência interna conhecida que gera um produto linear com seqüências terminais conhecidas. Isto pode agora ser usado para PCR (reacção em cadeia do polymerase).
4) O PCR padrão é conduzido com as primeiras demão complementares às seqüências internas conhecidas now.
Em resumo:
O PCR inverso funciona para clonar as seqüências que flanqueiam uma seqüência conhecida. As seqüências flanqueando do ADN são digeridas e ligadas então para gerar o ADN circular.
As primeiras demão do PCR que apontam longe das seqüências conhecidas são empregadas então para amplificar as seqüências flanqueando.
Aplicações do PCR inverso
O PCR inverso tem aplicações numerosas na biologia molecular que inclui a amplificação e a identificação das seqüências que flanqueiam elementos transposable, e a identificação de inserções genomic.
Protocolo inverso do PCR
Referências inversas do PCR
1. Ochman H, Gerber COMO, Hartl DL. Genética. 1988 novembro; 120 (3): 621-3.