PCR Inverso
Fundo Inverso de PCR
PCR inverso IPCR também chamado, e foi descrito primeiramente por Ochman et por al. em 1988 (1).
Uma limitação de PCR padrão é que as regiões 5' e 3'
flanqueando de seu fragmento do DNA do interesse devem ser sabidas.
PCR inverso permite que você conduza PCR quando você tem
somente a informação de uma seqüência interna.
A reação chain do polymerase inverso é um variant de PCR, e é usada quando somente uma seqüência interna do DNA do alvo é sabida. É conseqüentemente muito útil em identificar seqüências flanqueando do DNA de inserções genomic. Similar a outros métodos de PCR, PCR inverso amplifica o DNA do alvo usando o polymerase do DNA.
PCR inverso usa PCR padrão (reação chain do
polymerase), porém tem os primers orientados no sentido reverso da
orientação usual. O molde para os primers reversos é um
fragmento da limitação que ligated em cima dse para dar forma a um
círculo.
O Método Inverso de PCR
O método inverso de PCR inclui uma série das digestões e dos self-self-ligations com o DNA que está sendo cortado por um endonuclease da limitação. Este corte resulta em uma seqüência sabida em um ou outro fim de seqüências desconhecidas.
Etapas Inversas de PCR
1) o DNA do alvo é cortado levemente em
fragmentos menores de diversos kilobases pela digestão do
endonuclease da limitação.
2) o Self-self-ligation é induzido sob as concentrações
baixas que fazem com que a espinha dorsal do phosphate reforme.
Isto dá um produto circular do ligation do DNA.
3) o DNA do alvo é então limitação digerida com um
endonuclease sabido. Isto gera um corte dentro da seqüência
interna sabida que gera um produto linear com seqüências terminais
sabidas. Isto pode agora ser usado para PCR (reação chain do
polymerase).
4) PCR padrão é conduzido com os primers complementares às
seqüências internas agora sabidas.
Em resumo:
PCR inverso funciona para clone as seqüências que flanqueiam uma seqüência sabida. As seqüências flanqueando do DNA são digeridas e ligated então para gerar o DNA circular.
Os primers de PCR que apontam afastado das seqüências
sabidas são empregados então para amplificar as seqüências
flanqueando.
Aplicações de PCR inverso
PCR inverso tem aplicações numerosas na biologia molecular including o amplification e a identificação das seqüências que flanqueiam elementos transposable, e a identificação de inserções genomic.
Protocolo Inverso de PCR
Referências Inversas de PCR
1. Ochman H, Gerber COMO, Hartl Dl. Genetics. 1988 Nov;120(3):621-3.